膜片钳技术及其应用实例精要.ppt

膜片钳技术及其应用实例膜片钳技术及其应用实例王王 强强1南京医科大学公共卫生学院神经毒理实验室南京医科大学公共卫生学院神经毒理实验室内容提要内容提要l 离子通道离子通道l 膜片钳技术膜片钳技术（（Patch Clamp Technique））l 应用实例应用实例2被引用次数被引用次数13325一、离子通道一、离子通道•细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的内的通信通信是依靠其膜上的离子通道进行的，是依靠其膜上的离子通道进行的，离子离子和离子通道是细胞兴奋的基础和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量由此形成了一门细胞学科法进行测量由此形成了一门细胞学科—电生理电生理学（学（electrophysiologyelectrophysiology））•膜片钳技术已成为膜片钳技术已成为研究离子通道的研究离子通道的“金标准金标准” 4•电压门控性离子通道电压门控性离子通道：膜上通道蛋白的带点集：膜上通道蛋白的带点集团在膜电位改变时，在电场的作用下，重新分团在膜电位改变时，在电场的作用下，重新分布导致通道的关闭，同时有电荷移动，称为门布导致通道的关闭，同时有电荷移动，称为门控电流。

控电流•配体门控离子通道配体门控离子通道：神经递质（如乙酰胆碱）、：神经递质（如乙酰胆碱）、激素等与通道蛋白上的特定位点结合，引起蛋激素等与通道蛋白上的特定位点结合，引起蛋白构象的改变，导致通道的打开白构象的改变，导致通道的打开•机械门控离子通道机械门控离子通道：机械牵拉：机械牵拉•其他其他5二、膜片钳技术二、膜片钳技术l19761976年年 德国马普生物物理化学研究所德国马普生物物理化学研究所NeherNeher和和SakmannSakmann在在青蛙肌细胞上记录青蛙肌细胞上记录记录记录到到AChACh激活的激活的单通道离子电流单通道离子电流l19801980年年 SigworthSigworth等用负压吸引，得到等用负压吸引，得到10-100GΩ10-100GΩ的的高阻高阻封接（封接（Giga-sealGiga-seal），），大大降低了记录时的噪声大大降低了记录时的噪声l19811981年年 HamillHamill和和NeherNeher等引进了等引进了膜片游离技术和全细胞膜片游离技术和全细胞记录技术记录技术l19831983年年1010月，月，《《Single-Channel RecordingSingle-Channel Recording》》一书问世，一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑奠定了膜片钳技术的里程碑。

6Neher(1944-)Sakmann(1942-)共获共获19911991年诺贝尔奖年诺贝尔奖8膜片钳技术原理膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微膜片钳技术是用玻璃微电极接触细胞，形成吉欧电极接触细胞，形成吉欧姆姆(G(GΩΩ) )阻抗，使得与电极阻抗，使得与电极尖端开口处相接的细胞膜尖端开口处相接的细胞膜的膜片与周围在电学上绝的膜片与周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的对此膜片上的离子通道的离子电流离子电流( (pApA级级) )进行监测进行监测记录的方法记录的方法膜膜片片钳钳技技术术的的记记录录模模式式9全细胞膜片钳等效电流图全细胞膜片钳等效电流图1011膜片钳实验系统组成膜片钳实验系统组成放大器放大器转换器转换器刺激器刺激器防震台防震台显微镜显微镜微操纵器微操纵器探头探头屏蔽网屏蔽网监视器监视器 EPC 10 Plus膜片钳放大器膜片钳放大器武汉华中科大仪博武汉华中科大仪博 PC2CPC2C三、应用实例三、应用实例l 生精细胞生精细胞l 背根神经节神经元背根神经节神经元l 皮层神经元皮层神经元13 神经毒理研究室是现代毒理学教育部重点实验室和江苏省应神经毒理研究室是现代毒理学教育部重点实验室和江苏省应用毒理重点实验室的组成部分，在上世纪八九十年代就开始组建用毒理重点实验室的组成部分，在上世纪八九十年代就开始组建膜片钳实验室，属国内较早一批开展此工作的课题组，二十年来，膜片钳实验室，属国内较早一批开展此工作的课题组，二十年来，在导师肖杭教授领导、全体研究生的共同努力下，现在这门技术在导师肖杭教授领导、全体研究生的共同努力下，现在这门技术已经成熟稳定，并得到国际国内同行的认可。

已经成熟稳定，并得到国际国内同行的认可 14精子获能信号转导模式图精子获能信号转导模式图应用实例一：应用实例一：生精细胞离子通道学研究生精细胞离子通道学研究小鼠生精细胞电压依赖性小鼠生精细胞电压依赖性T型型Ca2+电流电流1、急性分离生精细胞、急性分离生精细胞机械分离法分离小鼠睾丸组织得到的细胞机械分离法分离小鼠睾丸组织得到的细胞单酶消化法分离小鼠睾丸组织得到的细胞单酶消化法分离小鼠睾丸组织得到的细胞•2、电极内液：、电极内液： CsMeSO3，，CsF ，，EGTA ，，Mg2ATP ，，Phosphocreatine ，，HEPES，调，调pH值至值至7.4 ，， 电极外液：电极外液： NaCl , KCl, MgCl2, NaHCO3 , NaH2PO4 , D-glucose , HEPES , CaCl2 ，用，用NaOH调调pH至至7.4•3、全细胞膜片钳、全细胞膜片钳小鼠生精细胞电压依赖性小鼠生精细胞电压依赖性T型型Ca2+电流电流小鼠生精细胞小鼠生精细胞T型型Ca2+电流密度曲线图电流密度曲线图 CaCa2+2+通道在通道在-60mV-60mV时激活，电流在时激活，电流在-30mV-30mV时时达到最大值，翻转电位约为达到最大值，翻转电位约为48mV48mV，峰电流，峰电流密度密度6.566.56±±1.08pA1.08pA··pF-1pF-1。

n=11)(n=11)电压门控性钙离子通道的动力学研究•激活（激活（Activation）：用激活曲线反映通道开）：用激活曲线反映通道开启的速度和难易程度启的速度和难易程度Boltzmann方程拟和：gCa/ gCa max={1+exp[-(Vm-V1/2)/ K]}-1（gCa max 峰电导的最大值，V1/2半数激活电压，K激活斜率因子） •稳态失活（稳态失活（Steady-state Inactivation）反映通）反映通道失活数目的电压依赖性，用失活曲线表示道失活数目的电压依赖性，用失活曲线表示ICa/ICa max={1+exp[(V-Vi1/2)/ Ki]}-1（ICa max 峰钙电流的最大值，V预刺激电压，Vi1/2半数失活电压，Ki失活斜率因子）•复活（复活（Recovery）用复活时间常数曲线表示）用复活时间常数曲线表示单幂指数方程拟和 ICa=Aexp(-t/r)+C（A起始时间，t为时间，r为复活时间常数，C常数）  失活曲线：失活曲线：失活曲线：失活曲线：分析细胞膜电位的变分析细胞膜电位的变化引起失活离子通道化引起失活离子通道数的变化。

半数失活数的变化半数失活电电(-60.79 0.24)mV，，斜率因子斜率因子(4.71 0.22)mV，，在在-90mV到到-40mV通通道失活T型型Ca2+通道激活和失活曲线图通道激活和失活曲线图   激活曲线：激活曲线：激活曲线：激活曲线：分析细胞膜电位的分析细胞膜电位的变化引起激活离子变化引起激活离子通道数的变化半通道数的变化半数激活电压数激活电压(-49.43 0.62)mV，，斜率因子斜率因子(6.05 0.55)mV，在，在-65mV到到-10mV通道开放通道开放 膜电位在膜电位在-90mV，施加一组，施加一组-80~ +70mV，以，以10mV递增的、波宽为递增的、波宽为200ms的指令电压方的指令电压方波，以波，以gCa与与gCa max的比值对的比值对Vm作图，数据作图，数据经经Boltzman方程拟和所得为方程拟和所得为激活曲线激活曲线激活曲线激活曲线；；以以 ICa与与ICa max 的比值对的比值对V 作图，数据经作图，数据经Boltzman方程拟和即为方程拟和即为失活曲线失活曲线失活曲线失活曲线 小鼠生精细胞T型Ca2+通道复活特征 钳制电位为-90 mV，给予50 ms，-20 mV的去极化刺激，间隔50 ms超极化至-110 mV，随后再给予-20 mV的去极化刺激引出T型Ca2+通道的复活电流经单指数方程拟合的复活曲线，r为144.93 ms 1 1、、Bay K8644Bay K8644对生精细胞钙电流的作用 小鼠生精细胞小鼠生精细胞T型钙离子通道的药理学特性型钙离子通道的药理学特性 Bay K8644Bay K8644为特异的为特异的L L型型CaCa2+2+通道激动剂，通道激动剂，低浓度即低浓度即可增大可增大L L型型CaCa2+2+通道电流，通道电流，但对但对T T型型CaCa2+2+电流无影响。

电流无影响实验发现加入实验发现加入5 5μμM Bay M Bay K8644K8644，，小鼠粗线期精母细小鼠粗线期精母细胞胞CaCa2+2+电流无任何变化，电流无任何变化，提示记录的提示记录的CaCa2+2+电流非电流非L L型型CaCa2+2+通道开放产生，也不通道开放产生，也不含有含有L L型型CaCa2+2+电流成分电流成分2、、CdCl2和和NiCl2对小鼠生精细胞对小鼠生精细胞Ca2+电流的作用比较电流的作用比较 Agent /µmol·L-1 n ICa/pA·pF-1Inhibition 加药前 加药后CdCl2 30 35.62±0.194.48±0.1020±4 10046.91±0.595.09±0.7526±13 30066.77±1.042.16±0.8368±8NiCl2 50310.50±0.838.20±0.9722±3 10048.51±0.663.69±1.0257±10* x ±s. P<0.05, compared with 100µmol·L-1CdCl2 在细胞外液中加入不同浓度的在细胞外液中加入不同浓度的NiCl2和和CdCl2，， 结果表明抑制作用结果表明抑制作用Ni2+>Cd2+NiCl2和和CdCl2是作用范围较广的是作用范围较广的Ca2+通道通道阻断剂，比较阻断剂，比较Ni2+和和Cd2+对对Ca2+电流抑制电流抑制作用的大小，可以区分作用的大小，可以区分Ca2+通道的亚型。

通道的亚型  CdCd2+ 2+ NiNi2+2+* *P<0.05P<0.05二价金属阳离子Cd2+、Ni2+可阻断电压依赖性Ca2+通道，但二者对L型和T型Ca2+通道的作用不同Ni2+在低浓度时主要阻断T型Ca2+通道而对L型Ca2+通道无效相反Cd2+对L型Ca2+通道更有效本实验观察了相同浓度（100M）的Cd2+（n=4） 、Ni2+（n=4）对生精细胞Ca2+通道电流的作用，得到Ni2+的抑制作用大于的抑制作用大于Cd2+，而Cd2+在较高浓度（0.5mM）才与100M Ni2+作用相近由由此我们确定在小鼠生精细胞记此我们确定在小鼠生精细胞记录的钙电流是由录的钙电流是由T型型Ca2+通道通道介导产生介导产生T型Ca2+通道有个重要特征，通道对通道对通道对通道对BaBa2+2+和和和和CaCa2+2+选择性相同选择性相同选择性相同选择性相同实验中加入与细胞外液Ca2+浓度相同的Ba2+，记录的Ca2+电流和Ba2+电流，在不同去极化电压下，Ca2+电流和Ba2+电流均无明显差异，表表明明我我们们记记录录的的小小鼠鼠生生精细胞精细胞Ca2+通道对通道对Ca2+和和Ba2+的通透性相同，符合的通透性相同，符合T型的特征。

型的特征 3、、BaCl2对生精细胞对生精细胞Ca2+电流的影响电流的影响4 4、硝苯地平、硝苯地平(nifedepine)对小鼠生精细胞T型钙电流的作用不同浓度硝苯地平对小鼠粗线期精母细胞T型Ca2+电流的作用 在本试验条件下，我们记录到的小鼠生精细胞内向电流经过通道电生理学特性和药理学特性两个角度鉴定，证实记录到的为证实记录到的为T T型型CaCa2+2+电流电流，无L型Ca2+通道电流成分并结合精子发生特点，提示精子顶体反精子顶体反应时应时CaCa2+2+的内流主要由胞膜的内流主要由胞膜T T型型CaCa2+2+通道完成通道完成27 加加入入1 1 molmol··L L-1-1氰氰戊戊菊菊酯酯后后，，CaCa2+2+通通道道的的激激活活电电压压向向超超极极化化方方向向移移动动，，提提示示CaCa2+2+通通道道的的激激活活阈阈值值降降低低，，在在-70-70～～-50mV -50mV CaCa2+2+电电流流比比加加药药前前增增大大，，在在-40-40～～+20mV +20mV CaCa2+2+电电流流被被抑抑制制，，但但翻翻转电位没有明显变化转电位没有明显变化。

氰戊菊酯氰戊菊酯( (Fen)Fen)加入前后加入前后CaCa2+2+通道电流－电压关系图通道电流－电压关系图(I-V (I-V 曲线曲线) ) 28应用实例二：应用实例二：神经细胞离子通道学研究神经细胞离子通道学研究动作电位时相图动作电位时相图 离子通道阻断剂离子通道阻断剂（如钠通道阻滞剂普（如钠通道阻滞剂普鲁卡因）现已成为麻鲁卡因）现已成为麻醉剂或治疗疼痛的药醉剂或治疗疼痛的药物物29小鼠小鼠DRG神经元电压依赖性神经元电压依赖性Na+电流电流小鼠小鼠DRGDRG神经元动作电位神经元动作电位30小鼠小鼠DRGDRG神经元电压依赖性神经元电压依赖性K K+ +电流的记录电流的记录DRGDRG神经元外向全钾电流神经元外向全钾电流DRGDRG神经元外向延迟整流钾电流神经元外向延迟整流钾电流DRGDRG神经元外向瞬时钾电流神经元外向瞬时钾电流31小鼠小鼠DRGDRG神经元高电压激活性神经元高电压激活性CaCa2+2+电流的记录电流的记录DRGDRG神经元神经元HVA CaHVA Ca2+2+电流电流I-VI-V曲线曲线32配体门控通道电流：配体门控通道电流：GABAGABA电流的记录电流的记录DRGDRG神经元神经元GABAGABA激活电流激活电流BicBic对对I IGABAGABA电流有明显抑制作用电流有明显抑制作用IsoIso使使DRGDRG神经元神经元I IGABAGABA电流幅值增大电流幅值增大大鼠胎鼠皮层神经元大鼠胎鼠皮层神经元 电压依赖性电压依赖性NaNa+ +电流的记录电流的记录33大鼠胎鼠皮层神经元大鼠胎鼠皮层神经元 电压依赖性电压依赖性NaNa+ +电流电流大鼠胎鼠皮层神经元大鼠胎鼠皮层神经元34Thank you for your patience!Any comment from you is highly appreciated!。