硕士研究生分子生物学实验讲义.doc

分子生物学实验讲义（研究生研究生试用）山西医科大学基本医学院生物化学与分子生物学实验室.6实验一 动物组织蛋白质的提取【目的规定】1．掌握动物组织蛋白质的提取措施 2．理解动物组织蛋白质提取的原理实验原理】 由于蛋白质种类诸多，性质上的差别很大，即或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用措施差别也很大，且又处在不同的体系中，因此不也许有一种固定的程序合用各类蛋白质的分离但多数分离工作中的核心部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质蛋白质在不同溶剂中溶解度的差别，重要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，另一方面取决于这些基团的排列和偶极矩故分子构造性质是不同蛋白质溶解差别的内因温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以运用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其他不需要的物质分开但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化液等）中，可以不必通过提取直接进行分离蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要合适的溶剂洗去可溶性的随着物，如脂类、糖类以及其她可溶性蛋白质，最后剩余的就是不溶性蛋白质。

蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等合适溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液试剂器材】1． 实验小鼠2． 0.9%NaCl3． 动物组织蛋白裂解缓冲液Tris 50mMNaCl 150mMEDTA 0.5mMDTT 1mMTriton X-100 1%去氧胆酸钠 0.5%SDS 0.1%4． PMSF/异丙醇储藏液 100mM（174mg/10ml）于-20℃储存5． -20℃储存的冰块【操作环节】1. 颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精擦拭皮肤，剪开腹部，剪切肝脏组织，称取0.6g，置于含预冷0.9%NaCl（6mL）的平皿中2. 在平皿中剪碎肝脏组织，并转移到匀浆器中3. 在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储藏液（20µL/2mL）4. 迅速将2mL 预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充足研磨5. 将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中，于4℃离心（1 4000rpm，10min）6. 离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5ml离心管中，即为组织蛋白粗提取液。

7. 所获蛋白提取液可保存于-20℃用于后续实验或用考马斯亮蓝等措施进行蛋白质浓度测定后保存备用注意事项】在整个制备过程中使组织始终处在冰浴状态，以防蛋白质的降解实验二 蛋白质的定量（Bradford法）【目的规定】掌握考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质含量的原理和措施实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是运用蛋白质与染料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度，具有迅速、敏捷的特点考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式蛋白质与G250的结合是通过范德华力实现的，并且在一定浓度范畴内两者的结合显色符合朗伯-比尔定律结合后的产物在595nm处具有最大吸取峰，通过对溶液的光吸取测定可获得与其结合蛋白质的量试剂器材】1. 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于25mL甲醇中，加入800 mL蒸馏水，再加入 100 mL 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤2. 原则蛋白质溶液（1mg /mL）：牛血清白蛋白100mg，加0.9％NaCl至100 mL3. 试管及试管架，吸管4. 比色计。

操作环节】 一、 原则曲线的制备：取5支试管，编号，按下表操作编 号 1号液 2号液 3号液 4号液 5号液原则蛋白质溶液（mL） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（1mg /mL）0.9％NaCl（mL） 0.8 0.6 0.4 0.2 －蛋白质浓度 200 400 600 800 1000（μg /mL）另取6支试管，编号为0～5，按下表操作 编 号 0 1 2 3 4 5 1号液 2号液 3号液 4号液 5号液 不同浓度蛋白质溶液（mL） － 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.9％NaCl（mL） 0.1 － － － － －考马斯亮蓝试剂（mL） 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100 混匀各管，室温下静置10分钟，于595 nm处进行比色。

二、 绘制原则曲线：以A 595 nm为纵坐标，原则蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制原则曲线三、 测定未知样品蛋白质浓度：测定措施同上，取适量未知样品，使其测定值在原则曲线的直线范畴内根据所测定的A 595 nm值，在原则曲线上查出其相称于原则蛋白质的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度注意事项】1． 在考马斯亮蓝试剂加入后的5－20分钟内测定光吸取，由于在此段时间内颜色最稳定2． 测定中，蛋白—染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽视的，测定后可用乙醇将比色杯洗干净实验三 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的规定】1.理解并掌握SDS-PAGE电泳原理及措施2.掌握垂直板电泳的操作措施实验原理】十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋白质，并可测定蛋白质的相对分子量，其原理重要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关：1．凝胶的分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体构造的微孔凝胶，蛋白质颗粒在电场中通过此凝胶时，会受到阻碍大分子蛋白质受到的阻力大，电泳速度小，而小分子蛋白质受到的阻力小，移动快，因而最后在凝胶中得以分离。

2．电荷效应：SDS是一种表面活性剂，在蛋白样品和PAGE凝胶中加入SDS，则能与蛋白质分子上的疏水基团结合，使蛋白质表面覆盖一层SDS分子由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量，因而掩盖了蛋白质分子自身的电荷差别，使多种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷，分子之间的电荷差别消失 3．变性效应：SDS同步还破坏了蛋白质中的非共价键，导致蛋白质变性，使SDS-蛋白质复合物在溶液中呈现相似的形状因此，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而重要取决于分子量的大小在进行SDS-PAGE电泳时，同步使用蛋白质分子量原则样品，则可以在电泳完毕后根据原则分子量大小得知样品蛋白质的相对分子量4．凝胶对样品的浓缩效应：SDS-PAGE使用一种不持续的缓冲系统，即分为低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液的pH值和离子强度也不相似电泳时，样品中的SDS-蛋白质复合物一方面通过浓缩胶，体积得到极大的浓缩，然后再通过度离胶被分离SDS-PAGE凝胶已经成为实验室常用的蛋白质分离措施，一般被用于蛋白质制品纯度的鉴定和蛋白质分子量的测定。

试剂器材】1．30%凝胶储藏液 　称取 30g 丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺0.8g，用去离子水配制成100ml 的溶液，过滤，贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存2．10%凝胶储藏液 　称取10g丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺0.5g，用去离子水配制成100ml 的溶液，过滤，贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存3．10% SDS 　用去离子水配制，贮存于室温中4．1% TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）5．10% 过硫酸铵 　用去离子水在临用前配制6．Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3）： Tris 　6.0g甘氨酸 　28.8g10% SDS溶液 　10 ml用蒸馏水定容至 　1000ml7．1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl 缓冲液 　称取Tris 181.5g，加适量蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至8.8，加蒸馏水至1000 ml8．0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液 　称取Tris 60.6g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至6.8，加蒸馏水至1000 ml。

9．0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液 　称取Tris 6.1g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至8.0，加蒸馏水至1000 ml10．2Ï样品缓冲液： 蔗糖 4g溴酚蓝 2mg10% SDS溶液 2ml5% β－巯基乙醇 0.5ml0.05mol/L Tris-HCl（pH 8.0） 2ml用蒸馏水定容至 10.0ml11．0.25%考马斯亮蓝R250 　将2.5g考马斯亮蓝R250溶解于450 ml 甲醇中，再加入450ml蒸馏水和100ml 冰乙酸，混匀，过滤除去颗粒物质12．洗脱液 　将50ml 甲醇和75ml 冰乙酸溶解于875ml蒸馏水中，混匀13．预染蛋白质分子量原则:117kD、90kD、49kD、35kD、26kD、19kD共6种蛋白质14．电泳槽、电泳仪、扫描仪、染色缸、摇床、一次性手套、微量加样器等。

操作环节】1． 制备凝胶（1）准备玻璃板，洗净、晾干按电泳槽使用阐明装好，按下表配制12%分离胶溶液和5%浓缩胶溶液： 表3-1：浓缩胶与分离胶的配制溶液成分 12%分离胶溶液(ml) 5%浓缩胶溶液(ml)30% 凝胶储藏液 　　 4.0 －10% 凝胶储藏液 　 　－ 2.51.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl 2.5 。