液相色谱仪基本配置和注意事项.doc

液相色谱仪基本配置和注意事项一、液相色谱仪的基本配置和构成有：液相泵、色谱柱、检测器数据解决、进样器、柱温箱二、液相基本组成1、输液泵2、进样单元3、分离单元（色谱柱）4、检测器三、常用液相单元的故障及解决1、输液泵2、手动进样阀3、色谱柱4、检测器（一）输液泵的操作液相色谱输液泵一般由入口单向阀、出口单向阀、注塞杆、泵密封圈等组成，是液相色谱的重要组成部分，要保持泵的良好操作规程必须维护系统的清洗，保证溶剂的纯度：（1）用高纯度的试剂和HPLC 级溶剂（2）过滤流动相和溶剂（3）脱气（4）再次使用前放空脱气，工作结束从泵中洗去缓冲液（最佳此外清洗柱塞）（5）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中（6）定期更换泵垫圈（7）查阅有关泵的操作手册（二） 手动进样阀1、对的的进样方式（1）手动进样阀在INJECT 位置：把取存试液的进样针导入进样孔，直到插入为止（必须穿过转子密封圈聚四氯乙烯套管）； （2）转动手柄到load 位置：把试液放入阀体中的定量环里；（3）同时转动手柄到INJECT 位置：试液进入液路2、进样前样品解决及注意事项（1）须用专用平头液相专用注射器进样（禁用气相尖头进样针）； （2）进样试液应无颗粒、浑浊和乳化，使用前先用超声波溶解后，须用0.45um 的过滤膜过滤；（3）部分装取样时，取样体积一般小于定管的50%，完全装液相取样体积取必须是定量环的5 倍以上（特别是高规定分析中外标定量）； （4）如流动相使用缓冲盐（或酸性、碱性）在使用结束时必须用蒸溜水在load 和INJECT 位置反复冲洗干净，因盐析出会损害转子、定子密封圈；3、进样阀故障及维护（1）在进样针与进样阀不相配（针外径偏小）情况，可以用铅笔的橡皮头将针导管压入少许，使密封环变小达成严格密封；（2）转子密封圈漏液的维护：① 转子密封圈少量漏液，拧松手柄六角螺钉，手柄沿轴方向送进，使手柄里的突出部嵌入压力调整螺钉缺口，旋转手柄1/20 圈，直到不漏液为止；② 转子密封圈损坏，通过方法①还漏液则需要更换转子密封圈。

拧下三个定子螺钉，从主体上卸下转子密封圈，用手柄拧松压力调整螺钉半圈（☆）安装上三个定子螺母均等地牢牢拧紧，再来调整压力螺丝拧到本来红色标记位置三）液相色谱柱1、对的的使用方法（1）进样的试样最佳称量，超声波溶解，样品过滤器过滤后进入色谱；（2）在有条件情况下，最佳一个样品使用一支色谱柱，可延长柱使用寿命；（3）色谱柱在使用后必须冲洗干净后方可保存过夜；（4）对于使用酸、碱、缓冲盐的流动相，柱子必须用蒸溜水（含5%有机溶剂）冲洗干净，再用甲醇、乙腈冲洗保护（对反相柱）2、色谱柱的维护（1）流动相所用试剂尽也许是色谱纯试剂，水最佳是超纯水或全玻璃双重蒸溜水；（2）流动相使用前用溶剂过滤器除去也许存在的微粒，流动相应现用现配对含盐的流液特别应注意长时间会产生细菌或出现沉淀；（3）柱子在使用过程中会产生：①塔板数下降②峰形变差③压力增长④保存时间变化为使柱子使用寿命延长A 天天使用完后必须当天冲洗干净；B 压力增大时，也许是过滤筛板污染，可以将柱头螺母卸下取出滤片并将其在20% 的硝酸溶液里超声波清洗约15 分钟，再用纯水超声波清洗10 分钟，重新装入色谱柱；（4）色谱柱的再生A. 反相柱分别用甲醇：水=90：10，纯甲醇，二氯甲烷做流动相依次冲洗，每次冲洗体积为柱体积的30 倍，然后以相反顺序冲洗；B. 正相柱分别用正己烷，异丙醇，二氯甲烷，甲醇做流动相依次冲洗，每次为柱体积的30 倍，甲醇冲洗完以后再以相反的顺序冲洗，至正己烷。

注意使用流动相必须严格脱水四）紫外检测器紫外检测器是应用最广泛的检测器，可测190-350mm 光吸取变化，其结构基本部件：氚灯流通值和传感器等等应注意事项：1、氘灯的注意事项（1）在开动液相色谱仪时最佳先开泵，等流入大体平衡后再开检测器，可以缩短氘灯使用时间，冲洗关机也同样先关检测器，后冲洗；（2）在分析中没有较长时间间隔，可以不关检测器2、流通池检测事项（1）流通池是各分离组分经色谱柱分离到检测器的通道流通池应定期清洗检查，定期更换池垫圈；（2）流通池常见故障是产气愤泡，噪音较大，流动相必须严格脱气，另一方面在检测器出口加一较长背压管；（3）不互相溶的溶剂没有中间过渡会产气愤泡，以及噪音变大，故必须用异丙醇过渡后再换上新的溶剂；（4）流通池自身污染限度可以在UV-254nn 处检查，样品池和参比池的两处的光能量结果来判断3、氘灯的更换（1）必须关闭检测器电源，等灯基本冷却后再操作；（2）氘灯使用可以通过检查实际使用时间和结合光能量来办；（3）氘灯更换必须戴手套，以防污染灯的表面产生噪声4）灯座位置必须安装到位4、流通池的清洗必须按照操作规程来解决（1）下池入口、出口、液路路管（2）用带金属接头的注射器连接池进口端、出口端注入异丙醇。

3）回抽10 毫升异丙醇通过池去掉残留流动相4）回抽10 毫升蒸溜水（5）回抽10 毫升60mol/L ，磷酸通过池去掉沉积物6）回抽20 毫升蒸溜水（7）用至少100 毫升蒸溜水正向通过池入口液相色谱仪常见故障的检查液相色谱仪常见故障的检查液相色谱仪根据目前市场情况，重要分进口和国产两大类液相色谱仪进口重要有美国产Waters 、安捷伦、赛尔泰、戴安、日本岛津等系列液相色谱仪；国产有大连依利特、大连江申、上海上分、上海伍丰、浙江温岭、北京温分等系列液相色谱仪各生产厂家生产的液相色谱仪性能也各有差别但液相色谱仪重要涉及三个系统：即输液泵、进样器和检测器系统输液泵系统重要有泵体、吸滤头、入(出)单向阀、柱塞杆、压力传感器、过滤器、排空阀等组成；进样系统重要阀体、定量环、进样针等组成；检测器重要由电路系统、光路系统、光源、检测池等组成要分析和判断色谱仪的故障所在，就必须要熟悉液相色谱工作输液和进样、检测这三大系统，特别是构成这三个系统部件的结构、功能色谱仪的故障是多种多样的并且某一故障产生的因素也是多方面的以下是液相色谱仪在使用过程中经常出现的故障现象以及解决方法，供大家参考和借鉴1、液相泵不输液也许的因素可采用的排除方法（1）吸滤头堵塞。

清洗或更换吸滤头（2）吸入管连接口漏液、重新安装或更换管路密封螺丝（3）入口、出口单身阀失灵、用超声波清洗或更换单身阀（4）泵腔内有气体、用10ML 注射器抽出其中气体（5）柱塞杆磨损、更换柱塞杆（6）泵头漏液、检查泵密封圈或清洗、更换密封圈2、系统压力偏高或压力波动大（1）管路过滤片污染 1、清洗过滤片或更换（2）管路堵塞 ，重新剪切，重新安装（3）手动进样器堵塞 ，检查进样器转子、定子及定量环，清洗或更新（4）保护柱污染 ，清洗或更换保护柱芯（5）色谱柱污染 ，清洗或更换（6）混合器污染(双泵) ，清洗混合器(内过滤片)或更换3、仪器使用基线漂移较大也许的因素可采用的排除方法（1）系统流动相未平衡好，稳定期间长一点（2）色谱柱使用后期污染，清洗再生色谱柱或更换（3）样品没走完，清洗管路或液路（4）检测器污染，清洗检测器和检测池5）流动相污染、不纯、未脱气、未过滤，使用HPLC 级试剂，充足过滤6）系统污染，清洗整个流路系统（7）氘灯能量局限性，更换氘灯（8）电源(电压)不稳定，安装稳压电源（9）室内环境较差，改善室内环境，保持一定温度和湿度（10）系统漏液，检查液路，保证流路不漏液、不堵塞。

4、保存时间重现性不好也许的因素可采用的排除方法（1）样品进样量相差较大，样品进样量保持一致（2）系统未平衡，系统平衡时间长一点（3）分析方法不合理，重新筛选色谱柱或流动相（4）色谱柱选择不合理或使用后期，清洗或更换色谱柱（5）流动相混合不均匀或试剂质量不好，混合时间长一点，选择HPLC 试剂（6）系统漏液，检查流路，保证流路不漏液、不堵塞5、测试样品出现分叉峰也许的因素可采用的排除方法（1）保护柱污染清洗或更换（2）色谱柱污染清洗或更换（3）进样阀污染清洗或更换（4）检测器污染清洗检测池、更换垫片或透镜（5）溶解样品的试剂选择不合理重新选择合适的试剂问：HPLC 灵敏度不够的重要因素及解决办法答：1、样品量局限性：解决办法为增长样品量2、样品末从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子3、样品与检测器不匹配：根据样品性质调整波长或改换检测器4、检测器衰减太多：调整衰减即可5、检测器时间常数太大：解决办法为减少时间参数6、检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗7、检测池中有气泡：解决办法为排气8、记录仪测压范围不妥：调整电压范围即可9、流动相流量不合适：调整流速即可10、检测器与记录仪超过校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

问：做HPLC 分析时，柱压不稳定，因素何在？如何解决？答：因素也许有：泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气解决：1、比例阀失效，更换比例阀即可2、泵密封垫损坏，更换密封垫即可3、溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；4、系统检漏，找出漏点，密封即可5、梯度洗脱，这时压力波动是正常的现代高效液相色谱中，分离效果好坏的一个重要指标是色谱填料的选择但是色谱填料的选择范围很宽，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的结识和了解    一、硅胶基质填料     1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料    由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的顺序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗杰出谱柱正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等    2、反向色谱 反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。

反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物样品流杰出谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保存    常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等    二、聚合物填料 聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在PH值为1—14均可使用相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效现有的聚合物填料的缺陷是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低    三、其它无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保存的基础，不再需其它的表面改性该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保存能力更强石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用氧化铝也可以用于HPLC氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。

但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强。