PCR熔解曲线法..pdf

1 PCR熔解曲线分析法是做realtime pcr时分析 用来确定不同的反应产物 包括非特异性产物的分析方法 原理是在扩增反应完成后 通过逐渐增加 温度的同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线 随着反应中双链DNA 变性 荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低 用荧光信号改变的 负的一次导数与温度作图 在扩增产物的溶解温度上有一特征峰 Tm DNA双链解链50 的温度 因为它们在不同的温度溶解 所以用这 个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开 2 溶解曲线是在正常的PCR反应基础上加一个溶解曲线的反应条件 其中 当温度由60 升至95 时 PCR仪每隔一定的温度检测一次信号 最后 将 收集的信号绘制出溶解曲线 然后将溶解曲线一次微分就会得到我们平 时看到的峰性图 每一条线代表着某个孔里的反应体系里产物的单一情 况 某一条线如果为 单峰且在一定合理的温度范围内 一般为80 90 则认为正常 如果为双峰则可能有非特异性扩增 由此可以判断产物是否 为目的基因且是否单一 内参有内 参的线 目的基因有目的基因的线 同一 条线不会出现两个基因的峰 3 这个一般是用SYBY Green作为荧光染料的时候需要做的工作 因为 SYBY Green染料是非特异的染料 只要有扩增 染料就可以镶嵌在双链中发 出荧光 我们做溶解曲线是为了观察我们扩增发出荧光的片段是不是我 们需要的产物 如果溶解曲线做出来只有单峰 且出锋位置是你的退火温 度 那么这个是你的产物发出的荧光 实验结果有效 如果出现多锋或退火 温度不对 那么这个实验结果是不可信的 你需要再次调整 4 用Syber Green方法做完PCR后 用来判断产物是否相对专一 反应结束 后 逐渐加温 和Syber Green分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单 链 就不能在和Syber Green结合 一般每加温一度 读一次信号 当温度到达 PCR产物的Tm时 产物解离一下增多 曲线的横坐标是温度 而纵坐标是荧 光信号的变化 开始加热 信号变化不大 所以几乎是平的 接近Tm时 突然 变化加大 所以出现峰值 再升温 产物全部解离 就又是一条直线了 如果 有非特异性产物 在加热过程中就会出现一些比较矮 宽的峰 5 熔解曲线 Dissociation curve 随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度 的曲线 总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度 Tm 不 同序列的DNA Tm值不同 DNA中G C含量越高 Tm值越高 成正比 关系 白话说来就是因为其中有非特异产物 包含两种以上的DNA序 列 所以才有两个峰 当然不排除极度偶然的情况 1 两个序列的熔解 曲线一样2 没有目标产物 只有一种非特异产物 。