降血糖动物实验.doc

辅助降血糖作用检查措施1动物实验1.1动物选择选用健康成年动物，常用小鼠（25±2g）或大鼠（180±20g），单一性别，大鼠每组8-12只、小鼠每组10-15只1.2材料1.2.1试剂四氧嘧啶（或链脲霉素）小鼠35-50mg/kg.bw.iv（100-160mg/kg.bw.ip）、大鼠50-80mg/kg.bw.iv（200-250mg/kg.bw.ip）用新鲜配制血溏测定试纸或试剂盒1.2.2仪器血糖仪、全自动生化仪、721-B型分光光度计1.3剂量分组及受试样品予以时间设1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组，根据人体每日每公斤体重推荐摄入量，小鼠扩大10倍作为其中一种剂量组（大鼠扩大5倍），根据受试样品的具体状况另设两个剂量组受试样品予以时间原则上不少于30天，也可根据实验需要自行设定期限1.4实验措施1.4.1减少空腹血糖实验1.4.1.1高血糖模型动物1.4.1.1.1原理四氧嘧啶（或链脲霉素）是一种β细胞毒剂，可选择性地损伤多种动物的胰岛β细胞，导致胰岛素分泌低下引起实验性糖尿病1.4.1.1.2造型动物禁食24小时后，予以四氧嘧啶造型，5-7天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值10-25mmol/L为高血糖模型成功动物。

1.4.1.1.3操作环节选高血糖模型动物按禁食3-5小时的血糖水平分组，随机选1个模型对照组和3个剂量组（组间差不不小于1.1mmol/L）剂量组予以不同浓度受试样品，模型对照组予以溶剂，持续30天，测空腹血糖值（禁食同实验前），比较各组动物血糖值及血糖减少的绝对值（即实验前后血糖的差值）1.4.1.2正常动物选健康成年动物按禁食3-5小时的血糖水平分组，随机选1个对照组和1个受试样品组（高剂量）余操作同1.4.1.1.31.4.2糖耐量实验高血糖模型动物禁食3-5小时，剂量组予以不同浓度受试样品，模型对照组予以同体积溶剂，15-20分钟后经口予以葡萄糖2.0g/kg或医用淀粉3-52.0g/kg，测定给葡萄糖后0、0、5、2小时的血糖值或人医用淀粉后0、1、2小时的血糖值，观测模型对照组与受试样品组给葡萄糖或医用淀粉后各时间点血糖曲线下面积的变化血糖曲线下面积=1/2×（0小时血糖值+0.5小时血糖值）×0.5+1/2×（2小时血糖值+0.5小时血糖值）×1.5=0.25×（0小时血糖值+4×0.5小时血糖值+3×2小时血糖值）.1.5数据解决及成果鉴定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检查，方差齐，计算F值，F值 降空腹血糖实验：受试样品剂量组与对照组比较，空腹血糖实测值减少有记录学意义，可鉴定该受试样品降空腹血糖实验成果阳性。

糖耐量实验：受试样品剂量组与对照组比较，在给葡萄糖或医用淀粉后、0.0、0.5、2.0小时血糖曲线下面积减少有记录学意义，可鉴定该受试样品糖耐量实验成果阳性1.6注意事项1.6.1为了使实验动物糖代谢功能状态尽量保持一致，也为了精确地按体重计算受试样品的用量，实验前动物应严格禁食（不禁水），实验前后禁食条件应一致，鼠类在禁食的同步应更换衬垫物1.6.2血糖测定用试纸或试剂盒，按阐明书操作；若自行配制试剂，按[附1]操作1.6.3如用血清样品进行测定，应于取血后30分钟内分离血清，分离后血清的含糖量在6小时内不变用血清制备的无蛋白血滤液可保存48小时以上1.6.4高浓度的还原性物质如Vit C亦能与色素原竞争游离氧，干扰反映，使成果偏低血红蛋白能使过氧化氢过早分解，亦干扰反映，致使测得血糖值偏低故对已溶血的全血或血清必须制备无蛋白滤液后，再进行测定[附1]血糖值测定措施1原理葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶作用下放出氧，使4-氨基安替比林与酚氧化缩合，生成红色醌类化合物，可在波长505nm比色测定2试剂配制磷酸盐缓冲液（0.2mol/L, PH7.0）0.2mol/L Na2HPO4 61ml，0.2mol/L KH2HPO4 39ml混合即可。

酶试剂葡萄糖氧化酶400u，过氧化物酶0.6mg,4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg加磷酸盐缓冲液至100ml，PH调至7冰箱寄存至少可稳定2个月酚试剂酚100mg溶于100ml蒸馏水中酶混合试剂取等量酶试剂和酚试剂混合在冰箱中可寄存1个月葡萄糖原则液储存液：无水D-葡萄糖（A.R.）在烤箱中80℃烤4小时，冷却后，寄存于干燥器中至恒重精确称取2g以0.25%苯甲酸溶液溶解并移入100ml容量瓶中，再用苯甲酸溶液稀释至100ml应用液：在100ml容量瓶中精确加入储存液5ml，再用0.25%苯甲酸溶液稀释至100ml，即1mg/mL应用液蛋白沉淀剂溶解磷酸氢二钠10g、钨酸钠10g、氯化钠9g于800ml蒸馏水中，加入1mol/L盐酸125ml，并用蒸馏水稀释至1000ml3操作环节取蛋白沉淀剂1ml加入血浆（血清）50ul混匀室温放置7分钟后，离心，取上清液（无蛋白血滤液）测定葡萄糖原则应用液亦进行同样解决测定管原则管空白管无蛋白血滤液mL0.5--解决后的葡萄糖原则液mL-0.5-蛋白沉淀液mL0.5酶混合试剂mL444混匀后，37℃水浴保温15分钟，用空白管调零点，在波长505nm处比色。

4成果计算2人体试食实验2.1实验设计实验采用随机分组，组间和自身两种对照设计2.2受试产品受试产品必须是具有定型包装、标明服用措施服用量的定型产品；安慰剂除功能成分外，在剂型、口感、外观和包装上与受试产品保持一致2.3受试者选择2.3.1纳入原则选择经饮食控制或口服降糖药治疗后病情较稳定，不需要更换药物品种及剂量，仅服用维持量的成年II型糖尿病病人，空腹血糖≥7.8mmol/L（140mg/dl）或餐后2h血糖≥11.1mmol/L（200mg/dl）；也可选择7.8mmol/L≥空腹血糖≥6.7mmol/L（120mg/dl）或11.1mmol/L≥餐后2h血糖≥7.8mmol/L的高血糖人群2.3.2排除原则2.3.2.1 I型糖尿病病人2.3.2.2年龄在18岁如下或65岁以上，妊娠或哺乳期妇女，对受试样品过敏者2.3.2.3有心、肝、肾等重要脏器并发症，或全并有其他严重疾病，精神病患者，服用糖皮质激素或其他影响血糖药物者2.3.2.4不合伙者（指不能配合饮食控制而影响观测成果者）2.3.2.5近3个月内有糖尿病酮症、酸中毒以及感染者2.3.2.6凡不符合纳入原则，未按规定服用受试样品，或资料不全影响观测成果者。

2.4受试者分组按受试者的血糖水平随机分为试食组和对照组，尽量考虑影响成果的重要因素如病程、服药种类（黄脲类、双胍类）等，进行均衡性检查，以保证组间的可比性每组受度者不少于50例2.5实验措施实验前对每一位受试者按性别、年龄、不同劳动强度、抱负体重参照本来生活习惯规定相应的饮食，试食期间坚持饮食控制，治疗糖尿病的药物种类和剂量不变试食组在服药的基本上，按推荐服用措施服用量每晶是食受试样品，对照组在服药的基本上，可不进行任何解决（或服用安慰剂）持续观测时间不少于30天，必要时可以合适延长2.6观测指标各项指标于实验开始及结束各检测一次，必要时实验中期血糖指标可加测一次2.6.1安全性指标2.6.1.1一般状况体征 涉及精神、睡眠、饮食、大小便、血压等2.6.1.2血、尿、便常规检查2.6.1.3肝、肾功能检查2.6.1.4胸透、心电图、腹部B超检查（仅实验前检查一次）2.6.2功能指标2.6.2.1症状观测具体询问病史，理解患者饮食状况，用药状况，活动量，观测口渴多饮、多食易饥、倦怠乏力、多尿等重要临床症状，按症状轻重积分，于试食前后记录积分值，并就其重要症状改善（改善1分为有效），观测临床症状改善率。

临床症状积分表无症（积0分）轻症（积1分）中症（积2分）重症（积3分）口渴多饮无有口渴感，饮水量<1000ml/日口渴感明显，饮水量1000-ml/日口渴明显，饮水量>ml/日多食易饥无餐前有轻度饥饿感餐前有明显饥饿感昼夜均有饥饿感倦怠乏力无精神不振，可坚持体力劳动精神疲乏，勉强坚持平常工作精神极度疲乏，不能坚持平常活动多尿症状消失，尿量<1800ml/日尿量1800-2500ml/日尿量2500-3000ml/日尿量>3000ml/日2.6.2.2空腹血糖观测试食前后空腹血糖值及血糖下降的百分率2.6.2.3餐后2h血糖观测试食前后食用100g精粉馒头后2小时血糖值及血糖下降的百分率2.6.3.4尿糖用空腹晨尿定性，按—、±、+、++、+++、++++分别积0、0、5、1、2、3、4分，于试食前后记录积分值2.6.2.5血脂观测试食前后血清总胆固醇、血清甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇水平2.7数据解决和成果鉴定凡自身对照资料可以采用配对t检查，两组均数比较采用成组t检查，后者需进行方差齐性检查，对非正态分布或方差不齐的数据进行合适的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检查；若转换数据仍不能满足正态或方差齐的规定，改用t’检查或秩和检查；方差剂但变异系数太大（如CV>50%）的资料应用秩和检查。

成果鉴定空腹血糖成果鉴定：①空腹血糖实验前后自身比较，差别有明显性，且实验后平均血糖下降≥10%，②实验后试食组血糖值或血糖下降百分率与对照组比较，差别有明显性满足上述两个条件，可鉴定该受试样品空腹血糖指标成果阳性餐后2h血糖成果鉴定：①餐后2h血糖实验前后自身比较，差别有明显性，且实验后平均血糖下降≥10%，②实验后试食组血糖值或血糖下降百分率与对照组比较，差别有明显性满足上述两个条件，可鉴定该受试样品餐后2h血糖指标成果阳性。