分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数.docx

实验目的:1. 用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数 Km和最大反应速率vM ___ Omax3.2. 了解底物浓度与酶反应速率之间的关系 掌握分光光度计的使用方法实验原理：酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质 它表现出特异的催化功能，因此叫生物 催化剂酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时， 总的反应 速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率， 反应速率最大Michaelis应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应速率和底物浓度的关系：Vm a xCs m a x s v = KCMs测定不同底物浓度时的酶反应米氏常数Km是反应速率达到最大值一半时的底物浓度速率，为了准确求得KM ,用双倒数作图法，可由直线方程:1 K 1 1MV Vmax Cs V max,1 以为纵坐标,V1 K R,—，斜率是1,直线与 V max Vmax1二为横坐标，作图，所得直线的截距是C s横坐标的交点为本实验用的蔗糖酶是一种水解酶， 它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。

该反应的速率可以用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示， 葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系， 因此可以测量不冋底物（蔗糖）浓度c的相应反应速率V,就可用作图法计算出米氏常数 SKM值以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率所三. 仪器与试剂：支iff心2机一台4支分光光度计10台）恒0温水浴一套二硝基水杨酸輛（即Dn称液管■潮扁10 醋酸缓冲溶液；蔗糖酶溶液；蔗糖（分析纯） ；葡萄糖（分析纯）四. 实验步骤:1 .蔗糖酶的制取在50ml的锥形瓶中加入鲜酵母10g，加入0.8g醋酸钠，搅拌15-20min 后使块团溶化，加入1.5ml甲苯，用软木塞将瓶口塞住，摇动10min,放入37C的恒温箱 中保温60h取出后加入1.6ml的4mol/L的醋酸和5ml水，使PH为4.5左 右混合物以 每分钟 3000转的离心机离心灶小时， 混合物形成三层，将中层移出，注入试管中，为粗制酶液2 . 溶液的配制⑴ 0.1%葡萄糖标准液(1mg/mL ):先在90C下将葡萄糖烘1h,然后准确称取1g于100ml烧杯中，用少量蒸储水溶解后，定量移至 1000ml容量瓶中。

2) 3,5-二硝基水杨酸试剂(即DNS): 6.3gDNS和262ml的2mol/LNaOH加到酒石酸钾钠的热溶液中(182g酒石酸钾钠溶于500ml水中)，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠， 微热搅拌溶解，冷却后加蒸储水定容到 1000ml,贮于棕色瓶中备用3) 0.1mol/L的蔗糖液：准确称取34.2g蔗糖溶解后定容至1000容量瓶中3 .葡萄糖标准曲线的制作 在9个50ml的容量瓶中，加入不同量0.1%葡萄糖标准液及蒸储水，得到一系列不同浓度的葡萄糖溶液分别吸取不同浓度的葡萄糖溶液1.0ml注入 9 支试管内，另取一支试管加入 1.0ml 蒸储水，然后在每支试管中加入1.5mlDNS 试剂，混合均匀，在沸水浴中加热 5min 后，取出以冷水冷却，每支内 注入蒸储水2.5ml，摇匀在分光光度计上用 540nm波长测定其吸光度由测定结果作出标准曲线4.蔗糖酶米氏常数km的测定在9支试管中分别加入 0.1mol/L蔗糖液、醋酸缓冲溶液，总体积达2ml，于35C水浴中预热，另取预先制备的酶液在 35 C水浴中保温10min,依次向试管中加入稀释过的酶液各 2.0ml,准确作用5min后，按次序加入0.5ml 2mol/L的NaOH溶液，摇匀，令酶反应中停止，测定时，从每支试管中 吸取 0.5ml酶反应液加入装有1.5mlDNS试剂的25ml比色管中，加入蒸储水，在 沸水中加热 5min 后冷却，用蒸储水稀至刻度，摇匀， 540nm 波长测定其吸光度。

实验所需仪器设备五. 数据处理：由各反应液测得的吸光度值， 在葡萄糖标准曲线上查出对应的葡萄糖浓度， 结合反应时间计算其反应速率V,并将对应的底物（蔗糖）浓度 cs , 一并用表格形式列出,11 ,,Km和vmax将—对—作图，以直线斜率和截距求出V Cs六. 思考题1 .为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？为什么会产生过冷现象？2 .试讨论本实验对米氏常数的测定结果与底物浓度、反应温度和酸度的关系。