《卫生检验蛋白质》PPT课件.ppt

临床生化检验吉大一院检验科孙淑艳 教授本次课的主要内容一.蛋白质代谢检查二.糖代谢检查三 .离子测定一 蛋白质代谢检查(一)TP测定:方法、原理、操作、临床意义及注意事项(二)ALB测定:方法、原理、操作、临床意义、注意事项 （一）TP测定1.1.TPTP测定方法简介测定方法简介: TP测定时常利用蛋白质的一些特性,如重复的肽键结构;酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收;与色素结合的能力;沉淀后的浊度;电泳的迁移率大小等来设计蛋白质的测定方法经典和常见的方法分述如下：凯氏定氮法凯氏定氮法:是经典的蛋白质测定方法,准确性好、精密度和灵敏度高、是公认的参考方法但操作复杂、费时,主要用于标准蛋白质的定值和对其他方法的校正双缩脲法双缩脲法：特异性高、准确度和精密度好，方法简便、显色稳定虽然灵敏度不高，但能满足临床对血清TP定量测定要求，是临床测定血清TP的常规方法一） TP测定1. TPTP测定方法简介测定方法简介:酚试剂法酚试剂法：灵敏度高达双缩脲法的100倍，有利于检出微量蛋白质，较合适于单一蛋白质检测紫外分光光度法紫外分光光度法：利用蛋白质在280nm处有吸收峰的特点，常用于测定较纯的酶和免疫球蛋白。

染料结合法染料结合法：常用氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼等，前三者主要用于蛋白电泳，邻苯三酚红钼可用于尿液和脑脊液中蛋白质的测定，简便快速、灵敏，但不同蛋白质结合力不一样，且试剂对比色杯有吸附作用化学比浊法化学比浊法：操作简便、灵敏度高，但影响浊度大小的因素较多，一般用于测定尿液、脑脊液等蛋白质含量较低的标本一） TP测定 2.2.双缩脲法测定双缩脲法测定TPTP原理原理: 蛋白质中的肽键在碱性溶液中与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物,此反应和两个尿素分子缩合生成的双缩脲在碱性液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似,故称之为双缩脲反应这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰,吸光度在一定范围内与血清总蛋白含量成正比,经与同样处理的蛋白质标准液比较,即可求得蛋白质含量至少含2个-CONH-基团才能与Cu2+络合，故氨基酸及二肽无反应，三肽以上才能反应. 碱性碱性 蛋白质铜离子 紫色络合物 试剂:成品试剂(液体单一试剂)双缩脲试剂含有：硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾、NaOH 标准液:蛋白质含量：50g/L 、60g/L 仪 器 ：生化自动分析仪、分光光度计 (一) TP测定3.3.双缩脲法测定双缩脲法测定TP TP 操作:(1).生化自动分析仪法 按试剂说明书提供的参数编程测定。

2).手工操作法: 混匀，37 10min，波长540nm处比色，蒸馏水调零，测各管吸光度计算 (一)TP测定4.4.双缩脲法测定双缩脲法测定TP: TP: 临床意义临床意义: 正常成人TP：60-80g/L(1) TP降低:见于蛋白合成障碍蛋白合成障碍(肝功严重受损时，蛋白合成减少，以ALB降低最显著)、蛋白丢失增加蛋白丢失增加( (严重烧伤,大量血浆渗出;肾病综合征;溃疡性结肠炎)、营养不良或消耗增加营养不良或消耗增加 、血浆稀释、血浆稀释(如静注过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留)2) TP增高：见于蛋白合成增加蛋白合成增加(多发性骨髓瘤,异常球蛋白增加)、血浆浓缩血浆浓缩( (急性脱水，外伤失血等)一) TP测定2.2.双缩脲法测定双缩脲法测定TP TP 注意事项注意事项(1)黄疸、严重溶血等有明显干扰,可用标本空白管消除如果标本空白管吸光度太高，可影响结果准确度,使测定结果偏高2).脂血混浊血清会干扰比色,使测定结果偏高,可用乙醚抽提3).显色温度控制在371,使用经校正的高级分光光度计(波长带宽2nm),比色杯光径1Cm比色4).血清蛋白质的含量一般用g/L表示,因为各种蛋白质的分子量不同,不能用mol/L表示。

5).生化自动分析仪测定时，黄疸、溶血、脂血等不合格标本一搬不进行测定一)TP测定2.2.双缩脲法测定双缩脲法测定TP TP 方法特点(1).双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比,与蛋白质种类,分子量及氨基酸组成无明显关系,各种蛋白质显色程度基本相同,显色稳定性好,试剂单一2).双缩脲法双缩脲法重复性好,RCV4%,CCV3.9%;线性范围0-140g/L,干扰少,使用单一的稳定试剂,操作简单、快速,适于手工操作及自动化分析,为TP测定的参考方法3).唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍,但能满足临床生化检验需要,对血清总蛋白定量较为适用;对蛋白质含量很低的其他体液如脑脊液、胸腹水和尿液等，不是合适的定量方法4).双缩脲法双缩脲法是临床测定血清TP首选最方便、最实用的常规方法 (二) 白蛋白测定（ALB）1.溴甲酚绿法测定溴甲酚绿法测定ALBALB:原理原理 ALB在的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时,可与带负电荷的染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰,其颜色深浅与ALB浓度成正比例,与同样处理的ALB标准比较,可求出ALB含量 白蛋白溴甲酚绿 蓝绿色复合物试剂:成品试剂,琥珀酸缓冲液、溴甲酚绿、聚氧化乙烯月桂醚（Brij-35）、叠 氮钠白蛋白标准液: 40g/L(二)ALB测定2.2.溴甲酚绿法测定溴甲酚绿法测定ALB ALB 操作操作(1).生化自动分析仪分析法(2).手工操作法波长628nm,空白管调零,试剂与血清标本混合后,立即在303s读取吸光度。

计算 (二)ALB测定3.3.溴甲酚绿法测定溴甲酚绿法测定ALB ALB 临床意义临床意义： 参考值34-48g/L(1).ALB增高:常见于严重脱水所致血浆浓缩2).ALB降低:与TP降低原因大致相同,主要见于:蛋白合成障碍蛋白合成障碍，蛋白丢失增加蛋白丢失增加, , 营养不良或消耗增加营养不良或消耗增加 , ,血浆稀释血浆稀释急性降低主要见于大出血和严重烧伤； 慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功受损、肠道肿瘤及结核病、慢性出血、 营养不良和恶性肿瘤等血清ALB低于20 g/L,临床出现水肿3).A/G比值 正常为1.5-2.5/1,ALB减少和/或球蛋白升高， A/G降低,严 重者，称为A/G比值 倒置4).先天性ALB缺乏症：ALB合成障碍，极少见二) ALB测定4.4.溴甲酚绿法测定溴甲酚绿法测定ALB ALB 注意事项注意事项(1).BCG是一种PH指示剂,变色域PH3.8(黄色)-5.4(蓝绿色),控制反应液 PH是本方法的关键2).BCG试剂也可用其他缓冲液如枸橼酸盐或乳酸盐缓冲液但琥珀酸盐缓 冲液的校正曲线通过原点,线性好,灵敏度高,为首选推荐配方3).Brij-35也可用其他表面活性剂代替,如吐温-20或吐温-80,灵敏度和线 性范围不变。

4).60g/L的白蛋白标准液与BCG结合后,在光径1.0cm,630nm测定吸光度应 为，如达不到此值，灵敏度较差5).BCG不但与ALB呈色,与血清中多种蛋白成分呈色,其反应速度较ALB慢. 故BCG与血清混合后，在30s内读取吸光度,可明显减少非特异呈色反应 为减少基质效应，最好用参考血清作标准二) ALB测定5.5.溴甲酚绿法测定溴甲酚绿法测定ALB ALB 方法特点方法特点(1).本法操作简便、快速,黄疸、溶血和中度脂血无干扰,可手工操作,也可自动化分析,是目前国内测定ALB的常用方法2).本法线性范围10-60g/L，RCV4%与溴甲酚紫法(BCP)比较,对 ALB特异性较差. (二) ALB测定6.6.溴甲酚紫法测定溴甲酚紫法测定ALB ALB 原理原理 ALB在的缓冲液中带正电荷,在有Brij-35存在，可与带负电荷的染料溴甲酚紫(BCP)结合形成绿色复合物，在波长603nm处的吸光度与ALB浓度成正比，与同样处理的ALB标准比较，可求出血清中的ALB含量 ALB溴甲酚紫 绿色复合物试剂:成品试剂醋酸缓冲液、溴甲酚紫、聚氧化乙烯月桂醚 （Brij-35）、叠氮钠ALB标准液: 40g/L仪器:生化自动分析仪、分光光度计。

二) ALB测定7.7.溴甲酚紫法测定溴甲酚紫法测定ALB ALB 操作操作(1).生化自动分析仪分析法(2).手工操作法 混匀，1min后603nm比色，空白管调零，读取吸光度计算加入物（ml） B S U血清 0.025ALB标准液 0.025 0.154mol/LNaCl 0.025 BCP试剂 5.0 5.0 5.0(二) ALB测定8.8.溴甲酚紫法测定溴甲酚紫法测定ALB ALB 参考值：36-46g/L注意事项：注意事项：(1).BCP溶液PH必须控制在范围内2).严重脂血对测定有干扰，应加做标本空白予以校正评价: BCP反应最适PH为5.20,接近-和-球蛋白的等电点,抑制了这两种球蛋白与BCP的非特异性反应,对测定ALB有较高的特异性.进口试剂多为此法BCP与ALB的反应为即时完全反应,不受时间和温度变化的影响,呈色后稳定1h以上本法兼有BCG法的所有优点,克服了BCG的多数缺点,成为测定血清ALB染料结合法中较好的一种方法BCPBCP法优点法优点:受球蛋白和其他血浆蛋白干扰较小,对测定ALB有较高的特异性. 与BCG法相比,灵敏度较低.此外,溴甲酚紫与非人源性的白蛋白结合力相当弱,与牛、猪等动物血清反应性仅为BCG的1/3，不适用于测定动物标本中的白蛋白, 机制尚待阐明。

二 糖代谢检查(一)血糖测定:原理、操作、临床意义及注意事项(二)糖化血红蛋白测定:原理、操作、临床 意义、注意事项 (一)血糖测定1.葡萄糖氧化酶法(glucose oxidase,GOD)测定葡萄糖 原理原理: :利用氧和水将GLU氧化为葡萄糖酸,并释放H2O2过氧化物酶(POD)在色原性氧受体存在时将H2O2分解为水和氧,并使色原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物,即Trinder反应.红色醌类化合物的生成量与GLU含量成正比试剂试剂:成品试剂(液体双试剂).R1:磷酸盐缓冲液:磷酸盐、4-氨基安替比林、葡萄糖氧化酶; R2: 过氧化物酶、苯酚. 葡萄糖标准液:5mmol/L仪器：生化自动分析仪、分光光度计 (一)血糖测定2.葡萄糖氧化酶法(glucose oxidase,GOD)测定葡萄糖操作：（1）生化自动分析仪法 按仪器说明书操作2）手工操作法 混匀,置37水浴15min，在波长505nm处比色，空白管调零，读取标准管和测定管吸光度计算 (一)血糖测定3.血糖测定临床意义临床意义 空腹血清葡萄糖为血糖升高见于：(1)生理性高血糖:摄入高糖食物后或情绪紧张肾上腺素分泌增加.(2)病理性高血糖见于： .糖尿病:胰岛素绝对或相对不足.内分泌腺功能障碍:甲亢、肾上腺皮质及髓质功能亢进及对抗胰岛素的激素分泌过多. .应激性高血糖：颅内压增高刺激血糖中枢,如颅外伤、颅内岀血、脑膜炎等(一)血糖测定3.血糖测定临床意义血糖测定临床意义 血糖降低见于：（1）.生理性低血糖 见于：饥饿和剧烈运动（2）.病理性低血糖 ： 特发性功能性低血糖最多见,依次是药源性、肝源性、胰岛素瘤等.胰岛细胞增生或胰岛细胞瘤等,使胰岛素分泌过多.对抗胰岛素的激素分泌不足,如垂体前叶、肾上腺皮质和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减少.严重肝病患者,由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下,肝脏不能有效调节血糖.(一)血糖测定4.葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖注意事项：注意事项：（1）.葡萄糖氧化酶（GOD）对-D-葡萄糖高度特异,葡萄糖完全氧化需要型到型的变旋 反应.某些试剂盒含葡萄糖变旋酶,可加速变旋.终点法中,延长孵育时间 可自发变旋.新配的葡萄糖标准液主要是型,需放置2h以上方可应用.（2）.本法可直接测定CSF葡萄糖含量,但不能直接测定尿葡萄糖含量.因尿 中尿酸等物质浓度过高,干扰过氧化物酶(POD)反应,造成结果假性偏低.（3）.标本以草酸钾-氟化钠抗凝血浆较好.可抑制糖分解（4。