氨基酸的测定方法比较分析0001.docx

食物中氨基酸的测定方法一、氨基酸自动分析仪法1. 原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜 色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙， 缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol2. 适用范围GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法本法适用于食物中的16种氨基酸的测定其最低检出限 为10pmol本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定3. 仪器和设备 3.1真空泵3.2恒温干燥箱3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20〜30ml用去离子水冲洗干净并烘干3.4真空干燥器（温度可调节）3.5氨基酸自动分析仪4. 试剂全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水4.1浓盐酸：优级纯4.2 6mol/L盐酸：浓盐酸与水1： 1混合而成4.3苯酚：需重蒸馏4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L4.5缓冲液： 一4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.24.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50% 的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。

4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的 氢氧化钠溶液调节pH至4.04.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓 盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.44.6茚三酮溶液4.6.1 pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2O） 168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到 1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.24.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1） 50ml加入4g水合茚三酮（C9 H4O3.H2O） 和 0.12g还原茚三酮（C18H10O6.2H2O）搅拌至完全溶解4.7高纯氮气：纯度99.99%4.8冷冻剂：市售食盐与冰按1： 3混合5. 操作步骤5.1样品处理：样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时 将其解冻后使用5.2称样：准确称取一定量样品，精确到0.0001g均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在10〜2 0mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。

将称好的样品防 于水解管中5.3水解：在水解管内加6mol/L盐酸10〜15ml （视样品蛋白质含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可 加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3〜4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3〜5min，再接到真空 泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态 下封口或拧紧螺丝盖将巳封口的水解管放在110±1°C的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50ml容量瓶内，用去离 子水定容吸取滤液1ml于5ml容量瓶内，用真空干燥器在40〜50C干燥，残留物用1〜2ml水溶解，再 干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mlpH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用5.4测定：准确吸取0.200ml混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释到5ml，此标准稀释浓度为5.00nm ol/50M，L作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量6. 计算上机样品液（50mL）中氨基酸量（nmol）=上机标准液（50mL）中氨基酸量（nmol） x样品峰面积氨基酸标准峰面积所以，100g样品中氨基酸的mg数=上机样品液中氨基酸量（nmol） xf xMrx100mxVx106式中f--样品的稀释倍数Mr--氨基酸的相对分子量m--样品质量（g）V--上机时的进样量（此处为50 UL）7.其他7.1测定条件（以Beckman-6300型氨基酸自动分析仪为例）缓冲液流量：20mL/h；茚三酮流量：10mL/h；柱温：50、60 和 70°C；色谱柱：20cm；分析时间：42min。

7.2标准出峰顺序和保留时间序号 出峰顺序 保留时间/min 序号 出峰顺序 保留时间/min1天冬氨酸5.559蛋氨酸19.632苏氨酸6.6010异亮氨酸21.243丝氨酸7.0911亮氨酸22.064谷氨酸8.7212酪氨酸24.525脯氨酸9.6313苯丙氨酸25.766甘氨酸12.2414组氨酸30.417丙氨酸13.1015赖氨酸32.578缬氨芨16.6516精氨酸40.757.3允许差：同实验室平行测定或连续两次测定结果相对偏差绝对值＜12%食物中氨基酸的测定方法二、食物中胱氨酸的测定方法…氨基酸自动分析仪法（过甲酸氧化）1.原理在用盐酸水解蛋白质的过程中，胱氨酸易被破坏，现多采用过甲酸氧化法将蛋白质中的胱氨酸及半胱氨酸氧化成半胱磺酸，其反应如下：SH NH2OSO3H NH2OCH2 CH COOH + 3H C OOHCH2 CH COOH+ 3H C OH半胱氨酸过甲酸半胱磺酸甲酸生成的半胱磺酸可在氨基酸自动分析仪上进行测定，与标准半胱磺酸比较，计算其含量2. 适用范围参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编写的食物营养成分测定法第三版适用于食物中胱 氨酸的测定。

3. 仪器水解瓶：耐压螺盖玻璃管或硬质试管，体积20〜30mL，用去离子水冲净并烘干，电热减压蒸发器4. 试剂过甲酸：取9mL分析纯甲酸加入1mL30%过氧化氢混合，在室温放置2小时以上5. 操作步骤5.1过甲酸氧化：称取一定量的食物样品置于水解瓶中，使样品含蛋白质在5〜10mg，加入1mL过甲酸试 剂，在室温放置3小时加1mL乙醇终止氧化将样品瓶置于电热减压器中，于45C减压蒸干，用1mL 去离子水淋洗瓶壁，再蒸干，反复3次，以除去过甲酸5.2盐酸水解：同食物中氨基酸（16种）测定方法5.3在Bekman6300氨基酸自动分析仪上，在注文50C时用pH3.25柠檬酸缓冲液洗脱，半胱磺酸的出峰时 间约在1.78分钟6.计算上机标准液中半胱磺酸量（nmol） x 样品峰面积上机样品液（50以）中半胱磺酸量=半胱磺酸 标准峰面积上机样品中半胱磺酸量（nmol）xD xMx100100g样品中胱氨酸mg数=WxEx106x2式中D：样品稀释倍数M：胱氨酸分子量（ng）W：称样量（g）E：上机时的进样量（此处为50gl）食物中氨基酸的测定方法（3）三、食物中色氨酸的测定“荧光分光光度法1.原理食物中蛋白质在酸水解过程中，其色氨酸极易被分解，本法用碱水解蛋白质，直接测定色氨酸的天然 荧光。

在蛋白质水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以检测到荧光在pH为11时，色氨酸的荧光强度比酪 氨酸大100倍，且两种氨基酸的荧光峰相差40多nm，利用此特点，可在有大量酪氨酸的存在下，检测色 氨酸的含量2适用范围参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编写的食物营养成分测定法第三版适用于食物中色 氨酸的测定3. 仪器3.1荧光分光光度计3.2减压蒸发器3.3螺旋盖大口瓶（瓶盖要有橡皮垫）3.4聚四氟乙烯管3.5小玻璃球3.6烘箱4. 试剂（1） 5mol/L NaOH:内含0.5%可溶性淀粉，临用前配制2） 4mol/L 尿素（pH=11）（3） 6mol/L 盐酸（4） 漠百里酚蓝指示剂：称取0.1g漠百里酚蓝加0.1mol/L氢氧化钠1.6ml，配成0.05%水溶液5） 高纯氮（含量99.999%）（6） 辛醇甲苯溶液：内含1%辛醇（7） 色氨酸标准液：（1mg/ml）:称取色氨酸标准，用0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，贮存于冰箱保 存5. 操作步骤5.1称取含粗蛋白质约5mg的食物样品，置于聚四氟乙烯管中，加含可溶性淀粉的5mol/L氢氧化钠1 ml， 加入1滴辛醇5.2将各管分别盖上小玻璃球，放入1只带螺旋盖的大口玻璃瓶中，将瓶置于减压蒸发装置中，加冰和盐降 温，减压至真空度1.3Kpa10mmHg以下，继续保持15min，充氮气再减压，如此反复3次，迅速旋紧大口 瓶的螺旋盖。

5.3将充氮气的大口瓶置于烤箱内，在110°C水解样品22小时5.4冷却大口瓶，用重蒸馏水将样品分别洗至25ml容量瓶中，（内含6N Hcl 0.7ml）用漠百里酚蓝为指示 剂调pH至中性，用重蒸水定容至刻度5.5吸取样品液1ml,于10ml带盖试管内，用pH11的4mol/L尿素溶液稀释至刻度，在激发波长为280nm, 发射波长为360mm下测定荧光强度，根据标准色氨酸的荧光强度曲线，计算样品中色氨酸含量5.6色氨酸标准曲线：用前将标准贮备液稀释成每ml含100，200，300，400“g的色氨酸标准系列取每种 浓度的标准液各1ml（双份）与样品管同样加试剂，同时水解，以色氨酸标准浓度为横坐标，荧光强度为 纵坐标绘制标准曲线6.计算每100g样品中的色氨酸含量（mg）=AxDx1001000XW式中A：根据标准曲线得到的每ml测定液中色氨酸的含量（mg）D：稀释倍数W：取样量（克）。