郜刚分子生物学-10-3-RNA操作.ppt

RNA的制备分子生物学技术分子生物学技术讲义讲义郜刚郜刚山西师范大学山西师范大学生命科学学院生命科学学院3DmodelofRNAmolecule,withphosphatebackbone(gray)andsecondarystructure(blue)5.3.1 RNA提取概述 要了解生物某个器官或结构的功能和作用机理，一个重要的方式就是从分子角度去研究其功能基因的表达和调控，而分离得到高质量的RNA是进一步研究进行的首要条件,比如从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在RNA的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节是必不可少的,也是最常使用的通过cDNA途径分析细胞基因表达的前提植物细胞内的植物细胞内的RNARNA主要是主要是 rRNArRNA（占占80808585）、）、tRNAtRNA及小分子及小分子RNARNA（占占10101515）和）和 mRNAmRNA（占占1 15 5）。

rRNArRNA含量最丰富，由含量最丰富，由25S25S、18S18S和和5S5S几类组成几类组成mRNAmRNA种类繁多，种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数数mRNAmRNA在在33端都有一个端都有一个polyApolyA尾巴，因此，尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷可根据此特性用寡聚脱氧胸苷( (OligodTOligodT) )层层析柱从总析柱从总RNARNA中将中将 mRNAmRNA分离出来一般情分离出来一般情况下，提取的总况下，提取的总RNARNA也可用于也可用于Northern Northern blotblot试验RNA分析 通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5g RNA，但其中大部分为rRNA及tRNA，而mRNA仅占1%5%虽然mRNA大小和序列各不相同，但在多数真核细胞mRNA的3末端都带有一段较长的多腺苷酸链这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽RNA分析其实是对组织细胞总RNA中的mRNA进行分析 最常用的方法主要有:原位杂交、RT-PCR、Northern ,另外还有: Sl 核酸酶作图分析、引物延伸法等 RNA是一类极易降解的分子 在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。

而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大 在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中 在其他分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂 各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶RNaseAStructureofH(PDBid:1JL1)generatedusingwithpreset:prettyRibonucleaseA(RNaseA)withthefourdisulfidebondsenlargedandhighlightedingreen无孔不入的RNases即使是100度高温或者是高压灭菌也不能完全灭活防止RNA酶的污染 1.如果可能，实验室应专门辟出RNA操作区，离心机，移液器，试剂等均应专用。

RNA操作区应保持清洁，并定期行除菌 2.如果可能，在超净台中按照细胞培养的要求进行操作，可以有效避免操作中引起的RNA酶污染3.操作过程中应始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染用具，尽避免使用一次性塑料手套塑料手套不但常常造成操作不便，且塑料手套的多出部分常常在器具的RNase污染处和RNase-free处传递RNase，扩大污染4.避免在操作中说话聊天也可以戴口罩以防止引起RNA酶污染 5.尽量使用一次性的塑料制品，尽量避免共用器具如tips，tubes等，以防交叉污染例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H，T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染而这些污染了的器具是RNA操作的大敌 6.关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染，买来后可直接用于RNA操作许多研究者用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA酶，从而导致实验失败7.配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶 8.所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，用双蒸水彻底冲洗，DEPC-H20浸泡过夜后灭菌。

9.无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性但氯仿会溶解某些塑料制品，应当注意 如用如用180干烤干烤8小时以上处理玻璃器皿，小时以上处理玻璃器皿，或用或用0.1的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品所用水以及相浸泡玻璃器皿和其它用品所用水以及相关的缓冲液也需要用关的缓冲液也需要用0.1DEPC水处理，水处理，但但Tris-Cl缓冲液等不可以用缓冲液等不可以用DEPC处理注意：注意：DEPC有致癌之嫌有致癌之嫌，必须小心操作，必须小心操作，防止接触与吸入防止接触与吸入！RNA酶抑制剂1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性DEPC即diethypyrocarbonate，中文名为焦碳酸二乙酯分子式为C6H10O5，分子量为162.142、异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用3、 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin) ：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活 5.其他SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用10.RNase AwayTM试剂可以替代DEPC，操作简单，价格低，且无毒性 只需将RNase AwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面，浸泡后用水冲洗去除，即可以快速去除器皿表面的RNase，并且不会残留而干扰后继实验 RNA制备方法1.1.苯酚法苯酚法：用：用SDSSDS变性蛋白并抑制变性蛋白并抑制RNaseRNase活性，经多活性，经多次酚次酚/ /氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaACNaAC和乙醇沉淀和乙醇沉淀RNARNA；2.2.胍盐法胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和：用异硫氰酸胍或盐酸胍和 - -巯基乙醇变巯基乙醇变性蛋白，并抑制性蛋白，并抑制RNaseRNase的活性，经酚氯仿抽提后再的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；沉淀；3.3.氯化锂沉淀法氯化锂沉淀法：因为锂在在一定：因为锂在在一定pHpH下能使下能使RNARNA相对相对特异地沉淀，但容易使小分子特异地沉淀，但容易使小分子RNARNA损失，而且残留损失，而且残留的锂离子对的锂离子对mRNAmRNA有抑制作用。

有抑制作用4.4.特定的特定的试剂盒试剂盒法法常用的有常用的有4 4种较为成熟的分离总种较为成熟的分离总RNARNA的方法，的方法，: :操作方案一：经典方法：苯酚苯酚+ +胍盐法胍盐法也是很少有人用的方法方案一：改良法：经典方法：苯酚苯酚+胍盐法胍盐法1. 取1.2 g幼叶放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10 mL离心管加入 4 mol/L异硫氰酸胍 4 mL 苯酚 3 mL 2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL 氯仿 0.6 mL 混匀，冰浴放置30 min 2. 4，8000 r/min，离心（机）13 min 3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中 DEPC处理烘干4. 加入2倍体积无水乙醇，-70，0.5 h 5. 4，8000 r/min，离心13 min6. 弃上清，在沉淀中加入1 mL 4 mol/L LiCl，使其溶解 7. 移入1.5 mL离心管中，冰浴2 h 8. 4，13000 r/min，离心15 min 9. 弃上清，在沉淀中加入400 uL DEPC水，再加入400 uL氯仿，混匀 10. 4，13000 r/min，离心6 min。

11. 取上清，并加入1/10体积3 mol/L NaAc（pH 5.0），2倍体积无水乙醇，-20，放置30 min 12. 4，13000 r/min，离心20 min 13. 将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次 14. 将沉淀RNA室温下稍干燥 15. 加30 uL DEPC水溶解，-70保存 Trizol法傻瓜法一步法总RNA提取试剂Trizol主要是由酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液不仅可直接用于从人类、动物、植物、细菌等细胞或组织中提取总RNA，而且还可以从样品中提取DNA或蛋白质纯化的总RNA完整性好，不受蛋白、DNA的污染可用于Northern杂交、RNA点杂交、poly(A)+mRNA的分离、体外转录、RT-PCR、RNase封阻分析以及分子克隆p185Trizol+异丙醇利用Trizol提取液抽提RNA，具体步骤如下：1.取幼叶约250mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5ml离心管；2.加入1mlTRIZOL提取液震荡摇匀；3.室温放置5min后，加入0.5ml的氯仿，剧烈摇动离心管5min；4.在8条件下，12000rpm离心15min；5.溶液分为两层，下层为酚氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管，加入0.5ml异丙醇在1530条件下，沉淀10min；6.然后在,28条件下，12000rpm离心10min，RNA沉淀管壁和底部；7.去掉液体部分，加入1ml75%酒精洗2次；8.风干后，加入25µlDEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80冰箱备用。

Trizol + 吸附柱加入液氮研磨加入Trizol，研磨转移至离心管剧烈涡旋离心，上清过柱消化DNA洗脱，回收RNA产量一般为115gRNA/mg组织或1106个细胞，A260/A280的比率一般在1.61.8之间试剂盒 聪明的傻瓜法QiagenRNeasy植物植物RNA提取试剂盒提取试剂盒依据胍盐法即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提依据胍盐法即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有取液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有RNase抑制剂，抑制抑制剂，抑制RNase活性，保证活性，保证RNA的完整性的完整性通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶液均质化，包括液均质化，包括RNA在内的分子物质通过离心柱在内的分子物质通过离心柱加入乙醇后，再过第二个离心柱，加入乙醇后，再过第二个离心柱，RNA就就结合在柱结合在柱子底部有硅胶的膜上，洗去其它杂质，最后用无子底部有硅胶的膜上，洗去其它杂质，最后用无RNase的水的水溶出溶出RNA该柱子可结合该柱子可结合100 g大于大于2。