骨髓间充质干细胞的分离培养1.docx

兔的骨髓间充质干细胞提取1.1兔骨髓MSC的分离 用3%戊巴比妥钠按1 mg/kg的剂量施以全身麻醉，另用 1%利多卡因于手术部位施以局麻；无菌操作下于右胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于 骨皮质上开出一直径约2〜3 mm的孔，使通达髓腔；用18号硬膜外穿刺针接5 ml 注射器，内含3000 U/ml的肝素0.1 ml,沿骨皮质上的孔穿入髓腔，抽出骨髓血约2 ml；抽出的骨髓血用平衡液洗涤两次后，离心1800R 5 min ；弃去上清液，沉淀用 Ham f12-10%FBS培养液重新打匀；用灭菌的0.17 mol/L饱和NH4Cl溶液按1 ： 5的 体积比加入已重新打匀的悬液中，4°C下保留10 min，取出再离心180xg，5 min； 弃去上清后，以几滴平衡液再悬浮后，用细胞计数板作细胞计数，确认有核骨髓细 胞量达106〜107后，即可进行原代培养接种用1.2兔骨髓MSC的原代培养将经上述培养分离所得的有核骨髓细胞按每孔 3x104个细胞的密度接种于6孔培养板内，加入Ham f-12培养液，于37C，10% CO2 条件下培养；于接种5 d后进行第1次换液，以后隔日换液每天随机抽取3只实 验动物的MSC作细胞生长动力学分析，各取此三者的1个培养孔用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37C、3〜5 min），并作贴壁细胞计数，直 至贴壁细胞铺满整个培养孔的底部。

将此3个实验动物MSC每天的细胞计数取平均 值，作原代细胞培养的生长曲线分析1.3兔骨髓MSC的传代培养原代培养一旦铺满整个培养孔的表面，即可用 0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37C、3〜5 min），然后按1 : 3的比例进行传代接种培养，并记为P1；传代培养过程中隔日换液，直至贴壁细胞 彼此融合，铺满整个培养孔的底面再重复以上操作，用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA 液将贴壁细胞消化分离（37C、3〜5 min），并按1 ：3的比例进行下一代传代接种 培养，并记为P2,余类推将随机抽取作原代培养细胞生长动力学分析的3个实验 动物MSC的P1代分为两组，一组连同其余样本的第1代一并留作后续实验用，另 一组则用作传代培养的细胞动力学分析传代培养的接种密度严格地控制于与原代 培养接种密度相同的水平以便于对照每天各取1个实验动物MSC的1个培养孔用 0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37C、3〜5 min），并作贴壁 细胞计数，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底面将此3只实验动物MSC每天的细 胞计数取均值，作传代细胞培养的生长曲线分析。

1.4兔骨髓MSC的自我更新能力分析 将随机抽取作原代、传代培养细胞生 长动力学分析的3只实验动物MSC由P1代开始，逐代进行传代培养，直至培养细 胞出现衰老征象，停止传代培养以细胞群体倍增值（population doublings, PDs） 作为分析兔骨髓MSC的自我更新能力的指标，每代细胞培养的PDs值按以下公式 计算3 :PDs=lg （培养后细胞计数/培养前细胞计数）/lg2将各代PDs值累加即得最终的累积细胞群体倍增值（cumulative population doublings, CPDs）兔的骨髓间充质干细胞提取1.3.1 骨髓MSCs的分离纯化与培养 兔仰卧固定于兔台上，予2%利多卡因局麻后，持16号骨穿针，沿胫骨平台垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3 000 U，0.2 mL）润洗过的10 mL无菌注射器，抽取骨髓4 mL，缓慢叠于等量Ficoll淋巴细胞分离液（密度1.077 g/mL） 上，以2 000 r/min的速度离心20 min，分离骨髓单个核细胞，收集界面上的细胞，移入另一 离心管，PBS洗涤，2 000 r/min离心5 min，反复2次，弃上清，悬浮于含10%胎牛血清的 DMEM培养基（青霉素100U/mL，链霉素100 U/mL），轻轻吹打均匀，接种到25 cm2培养瓶， 置37°C，5% CO2及饱和湿度培养箱中培养。

4~6d首次换液，以后每3d或4d换液1次， 14~21 d细胞生长融合达80%以上，以0.125%胰蛋白酶消化，按1:2比例传代培养，倒置显 微镜下逐日观察细胞形态1.3.2 骨髓MSC贴壁率检测 取对数生长期细胞，0.125%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1X105/mL，接种于24孔培养板，每次孔1 mL，每2 h取出培养板， 吸去4孔培养液，0.1mol/LPBS漂洗除去未贴壁细胞，0.125%胰蛋白酶消化后离心收集细胞， 进行细胞计数，共观察12 h，按以下公式逐个计算每个时相点的贴壁率：贴壁率=（贴壁细胞总 数/接种细胞总数）X100%1.3.3 骨髓MSCs生长曲线的测定 取第3代生长良好的细胞，用0.125%胰蛋白酶 消化后用含10%FBS的DMEM制备细胞悬液，以每孔103~104个细胞于不同时相分别接种于8 块96孔板中的8孔，每孔体积200 L，置于37C、5% CO2及饱和湿度培养箱中孵育于 第2天起行MTT比色法，每孔加入MTT溶液（5mg/mL） 20 L，37C继续孵育4h后，每 孔加入150 L二甲基亚砜，振荡10 min后选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各 孔光吸收值，以时间为横轴，光吸收值A （OD）为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.3.4 骨髓MSCs表面标记测定 取第3代MSCs，用0.125%胰蛋白酶消化，2 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，调节细胞浓度为1X106/mL，分为4份，分别滴加人抗兔 CD29、CD34、CD44、CD105 一抗（以PBS代替一抗作为阴性对照），室温反应30 min后，PBS 洗涤2次，滴加FITC标记的抗兔IgG，避光反应15 min后，经流式细胞仪检测细胞表面CD29、 CD34、CD44、CD105阳性细胞的表达大鼠的骨髓间充质干细胞提取第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及 肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠老鼠太老了，骨髓都 分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人 Wistar大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大② 我个人认为引颈处死不人道麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹 腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏 内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。

③ 老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取 下来也无妨浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青 链霉素的PBS10ml就行了，青链霉素的浓度为500U/ml,这样是区别于生长液中青 链霉素浓度，组织抑菌是200-500U/ml,生长液抑菌是20-100U/ml就当初步的消 毒吧！④ 整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的 冲洗老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩 下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个 60mm的皿里了，具体根据个人经验而言第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后， 再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生 长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲将骨髓冲出的细胞生长液至 60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中， 大约此时的细胞悬液为5ml。

心得体会：① 离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细 胞悬液的，这样可以节省一个皿② 5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可 能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml,可以加至5ml，这样是方便你计 数用的冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多培养皿倾斜45 度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰 度③ 换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞 无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使 用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒④ 以上的细胞生长液5ml具体配制为DMEM（90%）+胎牛血清（10%）+L-VC（忽略不计）+青链霉素（忽略不计）低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml 一瓶，大约60元）浓度 90%，5ml细胞生长液中大约需要4.5ml胎牛血清（HYCLONE公司的，500ml 一瓶，大约3600元）浓度为10%，5ml细胞生 长液中大约需要0.5mlL-VC（自己配）浓度为50ug / ml, 5ml细胞生长液中大约需要25ul青链霉素（HYCLONE公司的，100ml 一瓶，大约190元）浓度为10万U/ml, 5ml细 胞生长液中大约需要5ul至于NaHCO3, 一般是加的，浓度为7.5%，使细胞生长液的PH在7.0-7.2之间，但 是我不加，因为在细胞生长中会大量产生含N的分泌物，最好先拿试纸测一下。

再者在5ml细胞生长液中L-VC和青链霉素太少，可以忽略不计，但只是在配小剂量的 范围内，大剂量的话就要酌情改变第三步：细胞计数①从装有5ml细胞悬液的无菌容器中吸取20ul细胞悬液滴到一个 培养皿②用0.2ml的枪头吸取170ul的生理盐水，滴到20ul细胞悬液上③抽取10ul 的4%台盼蓝液滴到盐水和细胞悬液的混合液体中，用枪头在这三者的混合液中抽吸几 次，充分搅匀④抽取混合液中17ul点到放有载玻片的一个计数池中，刚好填满开 始计数并算出细胞数数量及浓度并按浓度分装到培养皿中心得体会：①计数的这个培养皿可以是污染的，只要看的干净就行② 混合的液体为20+170+10=200ul其中细胞悬液的浓度为10%，也就是说细胞悬液 被稀释了 10倍（也可以稀释至20倍，稀释的越多，更容易数清楚，但误差也随之增大）③ 计数公式：细胞数x104/ml=（四个大方格细胞数-4） x稀释倍数x104/ml比如，你数了四个大方格中有拒染细胞400个，那么根据公式算出（400-4）x10x104 /ml = 1x107/ml,现在有 5ml 的细胞悬液，也就是有 1x107/mlx5= 5x107个细胞。

当然这么多细胞，不全是我们需要的骨髓间充质干细胞，还有很多其他 像红细胞之类的，所以这就要设计到以后的换液纯化了④ 按 6-8xl06/ml 的浓度接种，故 5x107- 6-8xl06/ml = 8.3 -6.25 ml因为一般 60mm 的培养皿承载最多5ml的液体，故将5ml的细胞悬液再加入3ml的细胞生长液稀释成8ml的细胞悬液，各取4ml分装至两个60mm的培养皿此刻每个培养皿的细胞浓度为：(5x107)-8 =6.25xl06/ml,正好在要求的接种密度6-8xl06/ml范围内⑤ 将培养皿放置在37°C、5%CO2培养箱中常规培养第四步，48h后半量更换细胞生长液以后每3 d全量更换新鲜培养液，待细胞铺满培 养皿约80%时可进行传代，大约周期为7天。