琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化.docx

实验三 琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化一、 实验目的1、 掌握琼脂糖凝胶制备方法2、 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA方法3、 掌握PCR产物回收和纯化方法二、 实验原理根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动在一定的电场 强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主 要的影响因素DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比电泳过程中或电泳完毕，直接利用低浓度的荧光染料EB （漠化乙锭）进行 染色，EB可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出荧光，既 可以确定DNA条带在凝胶中的位置，而且灵敏度很高，少至1〜10 ng的DNA条 带即可直接在紫外灯下检出琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物试剂盒中 有一个特制的Column，将硅胶填充到这个特制的管中，利用硅胶在高盐低pH下, 吸附DNA，在低盐和高pH条件下DNA可再被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯 化此外还有玻璃奶（Glassmilk法），冻融法等方法 回收纯化DNA三、 主要实验仪器和试剂主要仪器：电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。

主要实验试剂：1、 50XTAE （2 M Tris, 1M 醋酸，50 mM EDTA （））2、 10X上样缓冲液（loading buffer）3、 分子量标准DNA Marker4、 琼脂糖5、 EB （漠化乙锭）（黑暗保存）6、 DNA回收纯化试剂盒（AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒）四、 实验步骤琼脂糖凝胶的制备：1、 将洗净的电泳槽洗净，置于平整的台面上，并调节水平；2、 用1 XTAE电泳缓冲液配制％的琼脂糖，微波炉加热使其溶解；3、 待琼脂糖溶液冷却至60° C左右时，加入EB （浓度约ug/mL），搅拌 均匀缓缓将琼脂糖倒入胶模中，厚度约5至7mm；4、 插入梳子，静待琼脂糖凝固；5、 将胶模放进电泳槽中，向电泳槽倒入1 XTAE电泳缓冲液，没过胶约5mm；6、 小心拔掉梳子，用20ul移液器吸取DNA溶液（20ul DNA加2〜3ul 10Xloading buffer），缓缓加入点样孔；并在最右边的点样孔加4 ul DNAMaker；7、 接通电源，（注意电源的正负极!）电泳20〜30分钟；8、 电泳完毕，关闭电源从胶模中取出琼脂糖凝胶，置于紫外灯下观察PCR产物切胶回收1、 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量。

100mg 凝胶，计100u l体积）（尽量缩短暴露UV灯下的时间！）2、 加入3个凝胶体积的Buffer DE-A （600 ul）,混合均匀后，于65° C加 热，直至凝胶完全熔化3、 加个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B （300 ul），混合均匀，当分离 的DNA片段小于400 bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇4、 吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml离心管中），12, 000X g离心1 min5、 将制备管置回2 ml离心管中，加500 ul Buffer W1, 12, 000X g 离 心30 sec,弃滤液6、 将制备管置回2 ml离心管中，加700 ul Buffer W2, 12, 000X g离 心30 sec，弃滤液重复一次7、 将制备管置回2川［离心管中，12, 000X g离心1 min彻底去除残 余的液体8、 将制备管置于ml离心管中,在制备膜中央，加25〜30 ul 65° C Eluent 或去离子水，室温静置1 min12, 000X g离心1 min洗脱DNA思考题：1、 如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率2、 琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响。