蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤.doc

蛋白质印迹分析实验原理和操作环节蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术措施待测蛋白既可以是粗提物也可以通过一定的分离和纯化,此外这项技术的应用需要运用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行辨认核心词：印迹蛋白质环节蛋白质印迹分析蛋白质印迹Westernblottingimmunoblotting免疫印迹法蛋白质印迹法【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术措施待测蛋白既可以是粗提物也可以通过一定的分离和纯化,此外这项技术的应用需要运用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行辨认 如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白一方面要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳措施进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；运用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白值得注意的是在加入一抗前应一方面加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而避免抗体与膜的非特异性结合经电泳分离后的蛋白往往需再运用电泳措施将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。

常用的两种电转移措施分别为:1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行由于湿法的使用弹性更大并且没有明显挥霍更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程对于目的蛋白的辨认需要采用可以辨认一抗的第二抗体该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶这种标记是运用辣根过氧化物酶所催化的一种比色反映，该反映的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别因此可通过对二抗的辨认而辨认一抗，进而判断出目的蛋白所在的位置其她的辨认系统涉及碱性磷酸酶系统和125I标记系统1. 实验器材SDS/PAGE实验有关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜（Millipore Immobion-P #IPVH 000 10）；Whatman 3MM 纸；其她工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘易生物仪器库：易生物试剂库： 2. 实验试剂⑴ 10x转移缓冲溶液（1L）：30.3g Trizma base(0.25M), 144 g甘氨酸(1.92M),加蒸馏水至1L, 此时pH约为8.3，不必调节。

⑵ 1x转移缓冲溶液（2L）：在1.4L蒸馏水中加入400 ml甲醇及200 ml10x 转移缓冲溶液⑶ TBS 缓冲溶液:将1.22g Tris (10 mM)和8.78g NaCl(150 mM)加入到1L蒸馏水中，用HCl调节pH至7.5⑷ TTBS buffer：在1L TBS 缓冲溶液中加入0.5ml Tween 20（0.05%）⑸ 一抗：兔抗待测蛋白抗体（多克隆抗体）6) 二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔⑺ 3% 封阻缓冲溶液（0.5L）：牛血清白蛋白15mg加入TBS缓冲溶液并定容至0.5L，过滤，在4°C 保存以避免细菌污染⑻ 0.5%封阻缓冲溶液（0.5L）：牛血清白蛋白2.5mg加入TTBS缓冲溶液并定容至0.5L，过滤，在4°C 保存以避免细菌污染⑼ 显影试剂：1ml 氯萘溶液 (30mg/ml甲醇配备)，加入10 ml甲醇，加入TBS缓冲溶液至50 ml，加入30 ul 30% H2O2⑽ 染色液：1g氨基黑18B (0.1%)，250ml异丙醇(25%)及100ml乙酸(10%)用蒸馏水定容至1L⑾ 脱色液：将350ml异丙醇(35%)和20 ml乙酸(2%)用蒸馏水定容至1L。

实验操作】⒈.蛋白质的分离根据目的蛋白的性质，运用电泳措施将其进行分离为提高电转移的效率，一般采用SDS/PAGE技术分离实验结束后，一方面将样品墙的上边沿用小刀清除，然后在胶板的右上角切一种小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用⒉.电转移⑴ 准备PVDF膜根据胶的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小应略微不不小于胶的大小将膜置于甲醇中浸泡1分钟，再移至转移缓冲溶液中待用 ⑵ 制作胶膜夹心 在一浅盘中打开转移盒，将一种预先用转移缓冲溶液浸泡过的海绵垫放在转移盒的黑色筛孔板上，在海绵垫的上方放置经转移缓冲溶液浸湿的3MM纸，小心地将胶板放在3MM纸上，并注意排除气泡将PVDF膜放在胶的上方同步注意排除气泡，再在膜的上方放上一张同样用转移缓冲溶液浸湿过的3MM纸并赶出气泡，放置另一张浸泡过的海绵垫，关闭转移盒将转移盒按照对的的方向放入转移槽中，转移盒的黑色筛孔板贴近转移槽的黑色端，转移盒的白色筛孔板贴近转移槽的白色端，填满转移缓冲溶液同步避免浮现气泡⑶ 电转移连接电源,在4°C条件下维持恒压100v，1小时⒊.免疫检测⑴ 膜染色断开电源，将转移盒从转移槽中移出，将转移盒的各个部分分开用镊子将PVDF膜小心放入一种干净的容器中，用TBS缓冲溶液进行短暂清洗，从膜上剪下一条宽约5mm的膜放入另一种干净的容器中。

将这条膜在染色液中浸泡1分钟，然后在脱色液中脱色30分钟,拟定蛋白质已经转移到PVDF膜上⑵ 膜的封闭和清洗对于没有进行染色的膜，一方面倒出TBS缓冲溶液,加入3%封闭缓冲溶液,轻轻摇动至少1小时倒掉3%封闭缓冲溶液，并用TBS缓冲溶液清洗3次, 每次5分钟⑶ 一抗倒掉TBS缓冲溶液，加入10 ml 0.5%封闭缓冲溶液及适量的一抗，轻轻摇动1小时以上沉着器中倒出一抗及封闭缓冲溶液，用TTBS缓冲溶液清洗两次，每次10分钟⑷ 二抗倒出TTBS 缓冲溶液，加入5 ml 0.5%封闭缓冲溶液及适量的二抗轻轻摇动30分钟，倒出二抗及封闭缓冲溶液，用TTBS缓冲溶液清洗两次，每次10分钟⑸ 检测倒掉TTBS 缓冲溶液，并加入显影剂，轻轻摇动PVDF膜，观测显影状况，当可以清晰的看到显色带时，用蒸馏水在30分钟内分三次清洗PVDF膜以终结显色反映的继续进行实验成果】检查膜上显色成果，蓝紫色带所相应的即是目的蛋白的位置。