探究如何优化与构建骨髓间充质干细胞向造血细胞分化的体外诱导体系.docx

探究如何优化与构建骨髓间充质干细胞向造血细胞分化的体外诱导体系造血干细胞具有很强的自我更新和分化成所有血细胞类型的能力,其持久重建是临床造血移植和基因治疗方案成功的基础,也是白血病和原发性免疫缺陷等多种疾病的救命疗法[1,2]然而,因HSC来源局限性及其不易在体外纯化扩增,导致HSC持久重建面临一定困难,使临床造血移植等治疗手段较难推进骨髓间充质干细胞具有取材方便、体外易分离、连续培养不会分化,移植具有不会或极少发生免疫排斥等特点,使它们成为细胞治疗、再生医学及神经退行性疾病等治疗的重要手段[3]多项研究表明,体外纯化扩增的间充质干细胞具有向造血细胞分化的潜能[4,5,6],这使MSC作为细胞供源替代HSC成为可能目前研究报道,体外诱导MSC向造血细胞分化的诱导条件不一,且各诱导条件的诱导分化效率如何尚未有相关性评估小鼠胚胎时期,HSC在定居于骨髓之前,其起源于胚胎的多个部位HSC最早出现在第7.5～9.5天胚(E7.5～E9.5)的卵黄囊(yolksac,YS)血岛[7]至E11时,HSC迁移至胎盘(placenta,PL),并于E10.5～E13.5其在PL数量急剧增多[8,9]随后,HSC通过胎儿血液循环系统迁移至胎肝(fetalliver,FL),于E13.5～E15.5在FL大量扩增[10]。

本研究旨在模拟胚胎期各造血部位的造血微环境,制备卵黄囊基质细胞条件培养液、胎盘基质细胞条件培养液和胎肝基质细胞条件培养液,体外诱导BMSC向造血细胞分化,并初步评估诱导分化效率,目的是为获得最佳体外诱导条件,为BMSC替代HSC在临床中的应用提供相关依据1、材料和方法1.1材料无特定病原体级,4～6周龄BALB/c小鼠和SD大鼠,体质量分别为18～22g、80～100g,购自安徽医科大学实验动物中心低糖DMEM、高糖DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司;藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的抗CD45抗体(CD45-PE)和异硫氰酸荧光素标记的抗CD34抗体(CD34-FITC)、FITC标记的大鼠抗小鼠CD29抗体(CD29-FITC)和PE标记的大鼠抗小鼠CD44抗体(CD44-PE)均购自eBioscience公司重组大鼠白细胞介素6、重组大鼠干细胞因子和重组大鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子均购自Novus公司荧光倒置显微镜购自ZEISS公司,CO2培养箱购自ThermoForma公司1.2方法1.2.1SD大鼠BMSC的培养与鉴定SD大鼠BMSC培养与鉴定参考课题组前期所用的方法[11]。

简述如下:自SD大鼠股骨或胫骨获得骨髓细胞,使用全骨髓结合差速贴壁法纯化、扩增BMSC取第5代BMSC进行鉴定,包括体外多向诱导分化和流式细胞术检测CD44、CD29、CD34和CD45的表达体外诱导包括向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化,BMSC经成骨诱导液诱导14d后,用茜素红染色;经成脂诱导液诱导15d后,用油红O染色细胞传代至第5代及以上,台盼蓝染色检测其活力后用于实验1.2.2小鼠胚胎不同造血部位的获取与HE染色于傍晚,将雌、雄鼠按2∶1合笼喂养;次日早晨观察,将见到阴栓的雌鼠标记好分笼喂养,此时胚龄记为0.5d(E0.5),采用此方法获取不同天数的孕鼠分别取E7.5～E9.5、E10.5～E12.5及E13.5～E15.5胚胎的YS、PL及FL一部分存放固定液中,用来进行HE染色,一部分存放含有抗生素(500IU/mL青霉素与500μg/mL链霉素)的无菌PBS中,用来进行细胞培养操作步骤:颈椎脱臼法将孕鼠处死,浸泡在750mL/L酒精约5min,移入超净台准备2个无菌的培养皿,在培养皿中加入含有抗生素(500IU/mL青霉素与500μg/mL链霉素)的无菌PBS接着打开小鼠的腹腔,暴露子宫,用镊子将子宫拉出腹腔。

剪断子宫颈和系膜,立即放入培养皿中,清洗1～2次剪开子宫,取出所有胚胎,放入另一个培养皿中显微镜下剥离胎膜与PL,分离出YS及胎体、剪开胎体的腹腔,暴露内脏,分离FL将获取的完整胎体、PL、YS和FL少部分存放于固定液,采用常规石蜡切片术制备切片并进行HE染色;将大部分PL、YS和FL放在含青-链霉素的无菌PBS中,用于细胞培养1.2.3YSSC-CM、PLSC-CM、FLSC-CM的制备将获取的YS用眼科剪将组织充分剪碎研磨后,用大口径吸管将预温的1g/L胶原蛋白酶消化液与组织块充分混匀,37℃恒温摇床上消化0.5～1h4℃,1000r/min离心5min,终止消化,200目筛网过滤,PBS洗涤滤液2次,用完全培养基(100mL/LFBS、高糖DMEM和100IU/mL青霉素与100μg/mL链霉素)重悬,计数后以(4～8)×105个/mL的细胞数接种于25cm2一次性培养瓶,放于37℃、50mL/LCO2及饱和湿度的恒温培养箱培养24～48h后全量换液,去除非贴壁的细胞待细胞生长汇合至80%～90%,换成无血清高糖DMEM培养液,继续培养24～48h,收集上清1000r/min离心5min,收集上清,用0.22μm孔径的过滤器过滤,即为YSSC-CM,-20℃保存。

使用时,YSSC-CM以40%体积比与完全培养液混合作为诱导条件培养液同理,制备PLSC-CM、FLSC-CM,但FL剪碎的组织,采用2.5g/L胰蛋白酶-EDTA分次消化获得细胞悬液1.2.4体外诱导SD大鼠BMSC向造血细胞分化、鉴定及分化效率取对数生长期的第5代BMSC,用2.5g/L胰蛋白酶-EDTA消化,常规制备成单细胞悬液,以5×104个/mL的细胞数接种到6孔板中,培养24h后更换各种诱导条件培养基,继续培养实验分为5组:YSSC-CM处理组、PLSC-CM处理组、FLSC-CM处理组、IL-6联合SCF(各50ng/mL)处理组和空白对照组培养7～9d,倒置相差显微镜观察细胞变化,收集培养液中的漂浮细胞,使用血球计数板计数有核细胞的数量,台盼蓝染色法检测细胞活力,然后进行以下实验1.2.4.1Giemsa染色检测分化细胞的形态收集各诱导组培养液中的漂浮细胞进行涂片,风干后,用Giemsa染色,显微镜下观察并拍照1.2.4.2免疫荧光细胞化学染色检测收集各诱导组培养液中的漂浮细胞,使用PBS洗涤2次后涂片,风干用预冷的丙酮固定20min,分别加入荧光基团标记的抗体:CD34-FITC和CD45-PE;4℃孵育2h,PBS洗涤2次,倒置荧光显微镜观察并拍照。

1.2.4.3集落形成实验检测rrGM-CSF处理后细胞的粒细胞/巨噬细胞形成单位数收集各诱导组悬液中的漂浮细胞,制备单细胞悬液以每孔2mL培养体系进行接种,每孔体系包括:(0.5～1)×105单个核细胞、9g/L甲基纤维素、300mL/LFBS、10g/L牛血清白蛋白、10-5mol/L二巯基乙醇、20ng/mLrrGM-CSF,DMEM培养液将上述各成分充分混匀后依次接种于6孔板中,放入37℃、50mL/LCO2及饱和湿度下培养2周,倒置相差显微镜下观察集落形成情况,≥40个细胞的细胞团为一个GM-CFU,计数每孔细胞集落的数目1.2.5统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学分析,组间比较使用t检验,P<0.05为差异有统计学意义2、结果2.1SD大鼠BMSC的培养和鉴定采用全骨髓法结合差速贴壁法从SD大鼠骨髓分离BMSC传代纯化后细胞形态趋于一致,以长梭形与纺锤形为主,细胞集落排列成鱼群状或旋涡状细胞体积较大,有1～2个圆形或椭圆形核,核仁清晰(图1A)成骨诱导可见典型的钙结节(图1B)成脂诱导可见细胞间和细胞内存在红色脂滴(图1C)流式细胞仪检测BMSC表面标志物CD29和CD44呈阳性表达,造血细胞表面标志CD34与CD45呈阴性表达(图1D)。

图1SD大鼠BMSC的培养和鉴定A:第5代SD大鼠BMSC形态(相差显微镜,×200);B:第5代SD大鼠BMSC成骨诱导结果(茜素红染色,×400);C:BMSC向脂肪细胞分化(油红O染色,×400);D:流式细胞术检测BMSC的CD44、CD29、CD34和CD45表达.2.2小鼠胚胎不同造血部位及形态特征体视显微镜下,无菌取材,胚胎、胎体、卵黄囊、胎肝、胎盘(图2),单个胚胎呈梨形剥离胎膜后,可见YS为一层富含血管的透明膜囊,包裹羊膜与胎体,附着于PL中心PL为一圆盘状结构,镜下观察PL胎儿面中央呈鲜红色,周边颜色较浅FL位于心脏下方,呈鲜红色,结构清晰可辩HE染色结果显示(图3):细胞核被染成深蓝紫色,细胞质被染成红色;FL细胞排列呈不规则索条状,索条连接成网,与肝血窦相互交错,血窦形状不规则,腔内含有大量原始血细胞;YS边缘不规则,细胞较少,可见有小血岛,内含有大个核的血细胞;PL为盘型,中央为胎盘迷路(placentallabyrinth,Lb),可见密集排列的细胞,其间可见较多腔面附着一层内皮细胞的胎儿毛细血管以及绒毛间隙,绒毛间隙中含有母体血液放大1000倍镜下,可见胎儿血管腔内富含大核的血细胞,而母体血中的血细胞无核且比胎儿毛细血管腔中的血细胞小。

图2体视显微镜观察E11.5的BALB/c小鼠胚胎不同造血部位A:小鼠单个胚胎(×15);B:剥离胎膜后,由卵黄囊包裹胎体连接于胎盘中心(×15);C:完整胎盘(胎儿面)(×20);D:卵黄囊包裹胎体(箭头指YS血管)(×20);E:卵黄囊(×20);F:胎体(箭头指FL)(×20).图3HE染色检测E11.5的BALB/c小鼠胚胎不同造血部位形态特征A:完整胎体;B:完整胎盘(×20;Lb:胎盘迷路;cp:绒毛膜板;);C:胎肝(FL;×400);D:卵黄囊(YS;×200);Bo、Co和Do分别是Lb、FL和YS标记为“*”部位放大1000倍的图像(箭头指血细胞);Bo中箭头指血细胞是胎儿毛细血管(fetalcapillary,FC).2.3YSSC-CM、PLSC-CM和FLSC-CM的采集消化后的卵黄囊、胎盘和胎肝细胞培养48h后,均可见有数量不等的贴壁细胞,呈多角形或梭形,每3～4d换液1次,5～7d细胞汇合可达80%左右(图4),此时换用无血清高糖DMEM培养液,培养箱培养24～48h后,收集上清,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌及细胞碎片,分别记为FLSC-CM、PLSC-CM和YSSC-CM。

图4原代培养第5天细胞图像(相差显微镜,×100)2.4体外诱导SD大鼠BMSC向造血细胞分化各组在诱导9d后,倒置相差显微镜下观察,实验组各组可见诱导组培养液的漂浮细胞逐渐增多,按照漂浮细胞数量由多到少,依次为FLSC-CM组、PLSC-CM组、YSSC-CM组,而IL-6联合SCF处理组与空白对照组仅见极少量漂浮细胞(图5)FLSC-CM、PLSC-CM、YSSC-CM处理组漂浮细胞呈圆形,细胞核清晰,折光性强,多散在分布于上清中,活力达90%以上各组漂浮细胞计数结果显示,FLSC-CM组最多,各实验组分别与空白对照组、IL-6联合SCF处理组比较,其中FLSC-CM组分别与PLSC-CM组、YSSC-CM组比较,差异较明显,有统计学意义(图5)FLSC-CM、PLSC-CM和YSSC-CM各诱导组培养液中的漂浮细胞经Giemsa染色后,漂浮细胞呈圆形或类圆形,细胞核清晰,细胞大小不一,体积较大的细胞类似于单核细胞,核较大,呈肾形或不规则形,体积小的细胞类似于淋巴细胞(图6),而对照组及IL-6联合SCF处理组均未见此类细胞荧光显微镜下,空白对照组及IL-6联合SCF处理组均未见有阳性细胞(图7A),FLSC-CM组、PLSC-CM组和YSSC-CM组镜下均可见表达阳性细胞,荧光强度较均匀,细胞膜呈现绿色荧光的细胞是CD34+细胞(图7),细胞膜呈现。