对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA 的再认识.doc

1对乙型肝炎病毒共价闭合环状 DNA 的再认识杨德刚 缪晓辉 乙型肝炎病毒共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA， cccDNA）是乙肝病毒前基因组 RNA（pgRNA）的转录模板，对乙肝病毒的循环复制以及感染状态的建立均有十分重要的意义从 cccDNA 的角度重新认识 HBV 感染和清除过程，有助于澄清现有的一些模糊概念，更深刻地理解HBV 的致病机制，更理性地确定抗病毒治疗的策略和目标，并有可能在移植后肝炎复发的防治等更为深远的领域带来新的启迪1 关于 HBV cccDNA 的稳定性1.1 cccDNA 池是动态更新的通常认为，HBV 感染后肝细胞核内 cccDNA 池在数量上保持相对稳定；但是，这句话不应该被误解为——组成该池的 cccDNA 分子也是固定不变的鸭肝细胞核内 cccDNA 的量受胞浆内包膜大蛋白水平调节，这是动态的负反馈平衡过程；作为负反馈调节的前提，构成 cccDNA 池的具体分子必须处于变化和更新当中，从头合成途径是 cccDNA 池补充和更新的主要方式 [1]HBV 的自发突变率能够保持在与 HIV 相近的高水平、核苷类似物抗病毒治疗后的病毒变异等现象，足以表明 cccDNA 池是动态更新的。

1.2 cccDNA 的转录活动成年人肝脏内肝细胞总数约为 2~3×1011个 [2]，慢性感染状态下这些肝细胞受 HBV 感染的比例为 5%~40%[3]；外周血病毒定量为 108~1011拷贝/毫升的 HBV 感染者，肝脏每天要向外周血释放约 1.3×101l~1.3×1014个病毒颗粒 [4]；据此推算，每个受感染肝细胞每天释放到外周血的病毒颗粒数量约为 3~3000 个每合成 1 个病毒颗粒所含的双链核酸即需要 cccDNA 完整转录 1 次；此外，每个病毒颗粒内尚含有 1 个病毒聚合酶，有约 180 个核壳蛋白、500 个表面包膜蛋白（大、中、主） ，外周血中含核酸的完整病毒颗粒与管形颗粒、小球形颗粒的比例约为 1：100：100，000——这些数量巨大的病毒蛋白均需由核内数量有限的cccDNA 模板转录生成短寿命的 mRNA 翻译得来这就意味着核内 cccDNA 分子其实是处于频繁转录过程中，在 DNA 拓扑异构酶作用下经常处于去超螺旋、作者单位：200003 上海，第二军医大学附属长征医院感染科 通讯作者：xhmiao@ 2解双链、转录后重新形成双链结构、再超螺旋化的动态变构过程中；HBV cccDNA 作为病毒转录的模板，从来就不是“一池死水” 。

1.3 cccDNA 池究竟有多大？既往认为，HBV 感染后平均每个肝细胞核内含有的 cccDNA 数量在 6～60 之间Zhang [5]等利用后天感染 DHBV 的成年鸭模型，收集从感染后第 11 天到第 131 天不同时点的肝脏标本，分离得到单独的肝细胞核，应用单细胞 PCR 扩增方法测出每个受感染细胞核内 cccDNA 的量结果发现 90%受感染的鸭肝细胞核内 cccDNA 数量在 1～17 之间；各个细胞之间 cccDNA 池含量变化较大，不符合正态分布规律；同一个体在感染的不同时点测得 cccDNA 池含量也不相同， “平均值”波动在 2.9～8.6 之间；许多受感染肝细胞核内只有 1 个或数个cccDNA 分子，并非通常认为的“cccDNA 池”那么大该研究因为单独分离肝细胞核并排除了未被感染的细胞，真实反应了“cccDNA 池 ”的大小；利用百分位数描述非正态分布数据，首次揭示了“cccDNA 池” 的分布规律该研究小组还利用传统定量方法验证得到类似并且更低的结果（cccDNA 池含量 “平均值”波动在 1.2～ 6.9 之间） ；另一研究小组在黑猩猩急性感染 HBV 活体模型中也计算得到类似的结果（平均 10 拷贝/细胞，在不同时间有波动） 。

实验方法的进步可以带来学术观念的更新：cccDNA 池即使在数量上也是不稳定的——它既非以往认识的那么大，也非以往认为的那么稳，cccDNA 池的概念及意义值得进一步探讨2 关于 HBV cccDNA 的清除动力学既往我们过度关注慢性 HBV 感染与 cccDNA 的关系，却忽略了一个重要事实，即成年人感染 HBV 后绝大部分（90%～95%）都是急性自限性的过程在此过程中，近乎 100%的肝细胞都曾经感染过 HBV，然而大部分被感染的肝细胞都通过非溶细胞途径清除了病毒 [6]，或者说，在保全宿主细胞的同时清除了HBV cccDNA这一过程不仅非常普遍，而且并不漫长（短于 6 个月？） ，深入研究其中机制，将为抗 HBV 治疗带来新的思路2.1 急性感染中 HBV cccDNA 的清除过程Wieland 等利用急性感染 HBV 的黑猩猩模型，全程观察了肝组织内 HBV cccDNA 的清除过程 [7]急性感染过程中肝细胞内 HBV cccDNA 数量迅速扩增，3平均倍增时间约为 3.8～4.2 天，大约第 7～9 周时达峰（平均 10 拷贝/细胞） ；肝细胞 HBcAg 阳性率增加过程与 cccDNA 基本同步或稍迟，最高可以达到 99%。

细胞内 cccDNA 的清除过程可以分为 2 个阶段：第一阶段为快速清除期（第8～12 周） ，此期 cccDNA 清除速度远远快于 HBcAg 阳性细胞减少速度，表明这是一个非溶细胞性的 cccDNA 清除过程，并且绝大多数 cccDNA 在该阶段得到清除（约 90%） ；第二阶段为慢速清除期（第 12 周以后） ，考虑与 CTL 的细胞毒效应及肝细胞再生有关，仅约 10%左右的 cccDNA 是在此阶段被清除总体看来，初建感染状态时 cccDNA 优先于 rcDNA 扩增，提示 cccDNA 易由从头合成途径迅速补充；占总量 90%的 cccDNA 可在很短时间内被消除，表明 cccDNA存在快速耗竭通道随访发现，虽然 2 只猩猩均表现为急性自限性感染过程，临床症状和生化指标恢复正常，但是肝组织内仍残存有痕量的“cccDNA” ；在慢性 HBV 感染者经抗病毒治疗后或是自发性的病毒清除过程中（血 HBsAg 和 HBV DNA 消失） ，也有着类似现象 [8,9]这些现象提示，可能自限性感染过程并不要求完全清除所有细胞内的 HBV cccDNA；认识并认可这些现象，对于合理确立抗病毒治疗的策略和目标具有重要意义。

2.2 细胞内 cccDNA 的半衰期测定在前述黑猩猩急性感染过程中，Wieland 等估算出 cccDNA 半衰期为 9～14天迄今为止，有关 cccDNA 半衰期研究的其他结果大致如下：Civitic 等在 DHBV 先天感染的原代培养鸭肝细胞中，用 5-溴 2-脱氧尿苷（BrUdR）标记 cccDNA，测得 cccDNA 的半衰期平均为 3～5 天；Delaney 等在转染了 HBV DNA 的 HepG2 细胞中应用拉米夫定抑制 HBV 复制过程，测得cccDNA 半衰期为 3 天； Guo 等在转染了 DHBV 的 LMH 细胞中应用拉米夫定抑制 DHBV 复制过程，测得 cccDNA 半衰期为 48 小时Addison 等用拉米夫定治疗先天感染 DHBV 的北京鸭 5 个月，然后取肝脏活检发现 5 只鸭中有 3 只 cccDNA 水平呈指数下降，其半衰期长达 35～57 天，另 2 只 70 天内呈指数下降，但此后稳定在 6 拷贝/ 细胞的水平；Zhu 等用 L-FMAU 治疗 WHBV 慢性感染的土拨鼠 30 周，测得 cccDNA 半衰期 33～50 天上述报道的结果相差甚远，既往曾把这一现象解释为宿主的“种属差异” 。

但是同为 DHBV cccDNA，半衰期却有 2～5 天和 35～57 天两个不同层次；而4DHBV 和 WHBV 作为不同病毒，在鸭和土拨鼠这两种不同宿主中的半衰期却如此相近（35～57 天、33～50 天） ，这显然不是种属差异所能解释进一步分析发现，较短的半衰期（2～5 天）均是在体外培养的细胞中测得；较长的半衰期（33～57 天）均是在活体肝脏中测得，可见不同的实验设计才是问题的关键2.3 cccDNA 真有这么长的半衰期吗？要获取细胞内 cccDNA 半衰期的准确数值，最重要的前提是确保在检测过程中没有新的 cccDNA 补充；或者，至少要证明新合成的 cccDNA 的量少到可以忽略不计但是在具体的实验设计中，这一重要原则往往被忽视Addison 等用拉米夫定治疗先天感染 DHBV 的北京鸭，5 只鸭中有 2 只cccDNA 水平先下降然后稳定在 6 拷贝/细胞的水平，这一现象表明：活体内药物未能有效阻止新生的 cccDNA 从头合成核内 cccDNA 是由胞浆内 rcDNA 补充更新的，作者在文中用了大量篇幅证明血中 HBV DNA 已经被药物明显抑制（下降幅度可达 5 个数量级） ，可是对于细胞内 rcDNA 水平却只字未提。

事实上，外周血中 HBV DNA 数量的明显减少并不代表肝细胞内的 HBV DNA 数量的同步减低临床观察表明接受拉米夫定治疗 1 年的患者外周血 HBV DNA 水平下降至治疗前的 1/330～1/1700，但是肝细胞内 HBV DNA 只下降至治疗前的2/3～1/3，细胞内病毒量并没有数量级上的变化 [10]单用拉米夫定或联合 PEG-干扰素治疗 1 年的患者，外周血 HBV DNA 定量下降 3.98～5.18 个数量级，肝细胞内 HBV DNA 数量却只下降 0.19～0.21 个数量级（即治疗前的 65%～61%） ，肝细胞内 cccDNA 下降了 0.068～1.07 数量级 [11]这些数据不仅可以解释现有的活体内 cccDNA 半衰期检测方法的局限性，也提示了目前抗 HBV 治疗的真正瓶颈所在综上所述，如果不能完全解决 cccDNA 半衰期测定技术的准确性问题，那么，应用现有文献资料描述的 cccDNA 半衰期数值去判断抗病毒治疗的效果就必须慎重，不能套用现有的 cccDNA 半衰期的概念和数值去预测抗病毒治疗的未来3 HBV cccDNA 检测的假阳性3.1 HBV DNA 的非法复制过程HBV DNA 的复制是个逆转录过程：1）以 pgRNA 为模板通过病毒 P 蛋白5的逆转录活性合成 HBV rcDNA 负链，同时 pgRNA 经由 P 蛋白的 RNA 酶 H 活性逐渐降解（残留 5’端长度为 18nt 的寡聚帽状核苷酸） ；2）pgRNA 5’端残留的18nt 的寡聚核苷酸转位到负链近 5’端 DR2 区域，以其末端 12nt 的序列与负链DR2 区域互补结合并作为引物开始合成 rcDNA 正链。

上述过程 2）中，正链引物正确转位到 DR2 位置（转位引发，translocation priming）是保证 HBV DNA分子形成正常的松弛环状结构（rcDNA）的关键若正链引物从 DR1 位置引发（原位引发，in situ priming） ，产物 HBV DNA 分子为线性双链，与相应的rcDNA 分子在序列结构上有重要区别原位引发现象又被称为非法复制（illegitimate replication） ，可占细胞内 HBV 复制过程的 5%～20%；相应的线性双链分子产物可以正确包装、分泌到细胞外并能感染新的细胞 [12,13]因为病毒频繁复制的巨大基数，经由非法复制途径产生的线性双链绝对数量并不算少，是感染后人肝细胞内 HBV DNA 的主要存在形式之一 [14]，已经足以干扰某些特异性检测 cccDNA 的方法并带来致命的假阳性3.2 假阳性的产生机制及控制方法目前用于 cccDNA 特异性检测的方法主要有三种，究其策略都是利用cccDNA 区别于 rcDNA 和其它复制中间体、异质性复制产物的结构连续性差异，从而实现检测的特异性。