番木瓜实生苗两性株的鉴定及其组培繁殖体系的建立.docx

番木瓜实生苗两性株的鉴定及其组培繁殖体系的建立LIXiaoying1，XIEXuzhi1，SHENWentao1，2，YANPu1，2，TUODecai1，2，ZHOUPeng1，2*1.InstituteofTropicalBiotechnologyandBioscience，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/HainanAcademyofTropicalAgricultureResource，Haikou，Hainan571101，China;2.KeyLaboratoryofBiologyandGeneticResourcesofTropicalCrops，MinistryofAgricultureandRuralAffairs，Haikou，Hainan571101，ChinaInthisstudy，theapicalstemofthehermaphroditicstrainofpapayaseedlingsidentifiedbymultiplePCRtechniquewasusedastheexplantstoestablishandoptimizeasetofpropagationsystemofpapayaseedlingsintissueculture.Theproblemofrootlessseedlingsandlowsurvivalrateoftransplantingweresolved.Intheexperiment，thehermaphroditeplantswereidentifiedbymultiplePCRandthestemtipswereculturedonMSsupplementwithBA0.5mg/L，NAA0.1mg/L，sucrose30g/L，agar6g/L〔pH5.8〕，andculturedat28℃for30days.TherootlessseedlingswereformedandsubdividedintosmallclustersandplantedonthestrongseedlingmediumMSsupplementwithBA0.5mg/L，KT0.25mg/L，NAA0.1mg/L，sucrose30g/L，agar6g/L〔pH5.8〕，culturedat28℃and2000lxfor30days.Therootlessseedlingswereinoculatedonthe1/2MSsupplementwithIBA0.75mg/L，NAA0.05mg/L，KT0.01mg/L，sucrose30g/L，agar6g/L〔pH5.8〕medium.Afterbeingculturedat28℃and1500lxfor20days.Inordertoobtainthebestrootingrateandsurvivalrateoftransplanting，therootlessseedlingsweretestedwithdifferentconcentrationsofnutrientrootingwateranddifferenttreatmenttime.TheresultsshowedthattheaccuracyofmultiplePCRtechniqueforsexidentificationwasover98%.Undertheconditionsof50mg/Lnutrientrootingwaterand8htreatment，therootingrateof‘Solo’was81.1%，andthesurvivalrateoftransplantingwas91.1%.Therootingrateof‘Mihong’was60%andthesurvivalrateoftransplantingwas86.7%.Theresultsobtainedbythetechniquearesuperiortothoseofmaturelateralbuds，andcouldbeusedinthecommercialproductionofpapayaseedlings.papaya;seedling;sexidentification;root-inducingrate;transplantsurvivalrate10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.014番木瓜〔L.〕属番木瓜科番木瓜属植物，为热带、南亚热带常绿软木质大型多年速生草本果树，常规生产种植使用种子培育的实生苗，由于其种性复杂，一般分为雌株〔占20%～30%〕、两性株〔占60%～70%〕和雄株〔占3%～5%〕。

两性株所结果实由于其果肉厚、果形美观均一等特点具有商品价值因此，利用种子培育实生苗应用于实际生产中时，等株性明确后必须采取“除雄去雌补种两性〞的工序，这会造成财力、人力的浪费，大大增加了生产本钱成龄侧芽组织培养技术可解决这一番木瓜生产上的问题，但由于该技术存在外植体灭菌难、催根难和移栽成活率低等问题，使得这一技术未能取代种子实生苗而规模化应用于生产中[1-3]实生苗茎尖组织培养技术由于番木瓜苗期性别鉴定技术的研究而得到了开发何尧声等【4】利用分子标记技术筛选获得了番木瓜性别特异SCAR标记的基因片段：番木瓜雄株特异基因片段〔1001bp〕、两性和雄性的特异基因片段〔225bp〕设计引物，对番木瓜苗期株性进行了多重PCR鉴定，其准确率几乎到达100%，用这一技术鉴定番木瓜实生苗株性是完全可行的但单株批量性别鉴定两性实生苗，用于实际生产中明显存在本钱提高的问题，而基于番木瓜实生苗性别鉴定技术的组织培养种苗繁育体系的研究至今未见报道番木瓜品种‘蔬罗’是主栽品种，生产上对优质种苗的需求量较大;‘蜜红’品种是三亚缘之海公司用‘小白’和美国‘line’品种杂交选育的品种，由于含糖量高〔>15%〕、有蜂蜜奶香味，近年来颇受消费者的青睐，果品的需求量大，种苗的需求量也大。

因此，本研究利用多重PCR技术鉴定筛選这2种番木瓜的两性株进行组织培养种苗繁育，建立和优化番木瓜实生苗两性株组培苗繁殖体系，不仅能解决成龄侧芽来源的无根苗催根难和移栽成活率低的问题，而且有利于番木瓜实生苗组培种苗的规模化生产和应用，这对促进番木瓜生产和相关产业的开展具有重要的现实意义材料每年9—11月份选择晴天午后3：00—5：00，从中国热带农业科学院热带生物技术研究所番木瓜课题组实验田栽培的‘蔬罗’‘蜜红’母株上采集外表呈“三画黄〞的番木瓜果实，用无菌水清洗番木瓜3次，转移到超净台后，用70%酒精仔细擦洗果实外表;假设果实较小，也可将整个番木瓜放入6%次氯酸钠溶液里浸泡，尽量使其淹没，过程中加以摇晃，8min后取出，用无菌水泡洗4～5次;把消毒纸垫在番木瓜下面后，用消过毒的刀子慢慢切开番木瓜，取出种子放到无菌滤纸上晾晒，然后用镊子把种子外表的膜去除，直接播种到MS或继代培养基中，每瓶培养基宜播种5～8粒种子，27～28℃，1500lx光照12h培养2～3周形成小苗备用预备实验中选择‘蔬罗’〔A〕、‘日升’〔B〕、‘穗中红’〔C〕、‘台农2号’〔D〕、‘蜜红’〔F〕等5个品种〔系〕大田两性株、雄株和雌株的嫩叶提取DNA进行多重PCR验证。

本预备实验中成龄植株两性株的DNA提取方法参照文献【4】营养生根剂：双吉尔-GGR〔含氨基酸水溶肥料〕为北京艾比蒂生物科技产品方法1.2.1实生苗性别鉴定〔1〕实生苗叶片DNA提取培养20d后种子萌发出幼苗，选取10株番木瓜幼苗分别在培养瓶底编号为1～10在超净台用消过毒的剪刀剪下1～2片嫩叶〔约100～200mg〕，装入相应编号的离心管里采用TIANGEN公司生产的植物基因试剂盒提取总DNA，具体操作方法见产品说明书〔2〕性别鉴定特异引物合成参考文献[4-5]利用分子标记技术筛选获得的番木瓜性别特异SCAR标记的基因片段：番木瓜雄株特异基因片段〔1001bp〕、两性和雄性的特异基因片段〔225bp〕设计并合成引物225bp引物：P15-GCACGATTTAGATTAGATGT-3;P25-GGATAGCTTGCCCAGGTCAC-31001bp引物：P35-GGGCTAGTCAATGTGCTAATGG-3和P45-GGGCTAGTCATCACTATCGC-3〔3〕多重PCR扩增和电泳分析预备实验：选择‘蔬罗’〔A〕、‘日升’〔B〕、‘穗中红’〔C〕、‘台农2号’〔D〕、‘蜜红’〔F〕等5个品种〔系〕两性株、雄株和雌株进行多重PCR验证实验。

采用25L反应体系：酶Mix缓冲液12.5L，4种引物各0.5L，基因组DNA1L，补足ddHO至25L扩增反应：94℃，3min后，进行94℃，30s;55℃，30s;72℃，1min;30个环循1.5%琼脂糖凝胶电泳：在120V电压下电泳20min电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像仪里观察分析多重PCR扩增结果检测实验：采用上述同样方法对‘蔬罗’‘蜜红’无菌实生苗进行多重PCR扩增，按事先编号对所属材料进行扩增及电泳分析，记录属于两性株的番木瓜实生苗编号，取其茎尖作为下一步组织培养繁育的材料1.2.2实生苗两性株无根苗诱导及繁殖取经性别鉴定为‘蔬罗’‘蜜红’两性株的幼苗茎尖，接种于MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L〔pH=5.8〕上，在28℃、2000lx条件培养约30d形成丛芽，分割成小丛芽接种于MS+BA0.5mg/L+KT0.25mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L〔pH=5.8〕上，在28℃、2000lx条件培养30d进行继代及壮苗培养1.2.3实生苗两性株生根诱导及移栽试验对检验获得的‘蔬罗’番木瓜两性实生苗茎尖进行继代培养，待扩繁获得继代苗并壮苗后，将无根苗分单株接种于1/2MS+IBA0.75mg/L+NAA0.05mg/L+KT0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L〔pH=5.8〕上，每次试验接种30株，重复3次。

其次利用比照试验将蔬罗无根苗浸泡在浓度梯度分别为10、25、50、75mg/L的营养生根水中6h，确定成苗率最高的生根水浓度，再以此浓度做不同梯度浸泡时间试验，分别为2、4、6、8h，最终确定成苗率最高的生根水浸泡时间挑选生根培养基里长势良好的‘蔬罗’木瓜苗，根据1.2.3获得的生根水最正确催根浓度与最正确浸泡时间浸泡木瓜苗，分3次移栽，每次分别移栽了38、36、39株，做好试验记录，统计实生苗两性株的移栽存活率以上催根试验同时以‘蜜红’品种作比照验证1.2.4实生组培苗田间株性鉴定经多重PCR筛选出的实生两性株经过组培苗培育移栽田间4个月，待其开花结果时从花型上观察性别，以此来验证PCR技术鉴定的番木瓜实生苗性别的准确性数据处理利用Excel软件和SAS软件对试验得到的相应数据进行方差显著性分析利用多重PCR鉴定实生苗性别结果多重PCR预备实验扩增结果如图1以雄株总DNA为模板得到1条1001bp和1条225bp的扩增产物带，以雌株总DNA为模板无扩增产物，以两性株总DNA为模板得到1条225bp的扩增产物带将多重PCR扩增获得的1001bp和225bp的扩增产物回收、克隆并送到大连Takara公司进行测序，应用VectorNTI9.0分析软件对测序后的序列进行分析，测序后的序列与番木瓜性别特异基因序列的同源性到达99%以上。

可见根据多重PCR扩增结果，能够准确地将番木瓜两性株鉴定出来，可用于番木瓜种子实生苗两性株的筛选利用上述方法对10株‘蔬罗’番木瓜实生苗进行多重PCR性别鉴定，扩增结果〔图2〕显示：1、3、5、7号DNA样品能扩增出225bp条带，说明所对应编号的4株番木瓜实生苗那么为两性株2、4、6、8、9、10未扩增出DNA条带，那么为雌株。