胶质瘤耐药基因的筛选及胶质母细胞瘤细胞系TLC1的建立和鉴定.pdf

天津医科大学博士研究生论文摘要[ 目的]胶质瘤是最常见的脑肿瘤，其中弥散性浸润的星形细胞瘤约占6 0 ％手术和放射疗法是治疗恶性胶质瘤的主要手段胶质瘤的治疗和预后受多种因素影响，化疗效果不理想有多方面的原因：首先，对中枢神经系统肿瘤有效化疗药物的抗瘤谱不能完全肯定，因此很难根据肿瘤细胞的病理类型来选择药物；其次，胶质瘤本身对化疗药物耐药，未能针对不同个体与肿瘤类型选择敏感药物也是重要的原因；还有，选用难以通过血脑屏障、与肿瘤细胞动力学特性不符的化疗药物也会影响化疗效果因而进行胶质瘤化学治疗敏感性、抗药性的检测和研究，对指导临床化疗药物的选择具有重要意义本研究通过从临床收集胶质瘤标本M T T 区分化疗药物敏感和耐药组织、诱导胶质瘤细胞系建立耐药细胞株、原代培养建立新的胶质母细胞瘤细胞系，利用基因芯片分别比较基因表达谱的差异，筛选出与化疗药物耐受相关的基因并证实其表达为对不同个体胶质瘤化疗药物的选择提供有力的理论依据和应用工具，同时也为其他肿瘤特异性化疗药物的选择奠定基础[ 方法]1 ．原发性耐药相关基因的筛选方法：收集临床手术切除的胶质瘤组织，原代培养的肿瘤细胞由M T T 体外测定ⅥI l 一2 6 对胶质瘤的抑制率，按照4 5 n g ( I P P C )时，抑制率> 3 0 ％为敏感， 9 0 ％。

9 ．4 m l 细胞培养液接种至5 0 m l 塑料培养瓶中，3 7 “ C5 ％c 0 2 孵箱中培养，每隔三天换培养液一次1 6天津医科大学博士研究生论文三、M T T 法检测V M - 2 6 对原代人胶质瘤细胞的细胞毒作用：1 ．组织消化后的细胞悬液以5 X1 0 4 —1X1 0 5 ／孔接种9 6 孔板2 ．9 6 孔板中每孔加入9 0 1 上i 细胞悬液及1 0 9 1 不同浓度v M 一2 6 ，使其终浓度分别为0 ．4 5 ，4 ．5 ，4 5 ，4 5 0 n g ／孔( 相当于0 ．0 1 、0 ．1 、1 、I O P P C ) ，每一浓度设三个复孔；同时设细胞对照，3 孑L ，每孔加9 0 1 x i 肿瘤细胞悬液；空白对照3孔，每孔加9 0 1 上I 细胞培养液两组对照均加入1 0 9 1 不含药物的无血清M E M - a ，各孔终体积为1 0 0 9 1 置3 7 “ C 、5 ％c 0 2 孵箱培养3 ．取出培养板，5 5 0 9 离心5 分钟，去上清，每孑L 加入1 0 0 p iD M S O 终止反应并溶解蓝紫色甲赞颗粒，震荡混匀，I J Q u a n t 酶标仪测波长为5 7 0 h m 的各孔吸光度值( O D 5 7 0 ) 。

4 ．抑制率的计算：抑制率= ( 细胞对照组O D 5 7 0 一试验组O D 5 7 0 ) ／( 细胞对照组0 D 5 7 0 一空白对照组0 D 5 7 0 ) X1 0 0 ％5 ．根据不同浓度梯度的抑制率拟合曲线，选择剂量反应关系良好的标本，以Ⅷ一2 6 为4 5 n g ／孔( 1 P P C ) 浓度下，胶质瘤细胞抑制率> 3 0 ％为敏感， 3 0 ％为敏感， 0 ．0 5 ) ，第3 8 、“、5 2代细胞I c 如没有显著性差异( P > 0 ．0 5 ) ，但是第1 0 和2 3 代与第3 8 、4 4 和5 2代的I c 5 0 却有显著性差异护( o ．0 5 ) c o f l c e n Ⅱa t i o n s图卜2 不同浓度V M - 2 6 作用T L C l4 8 小时抑制率曲线磐2S口jEE霉芒P6目o￡ul天津医科大学博士研究生论文四、总R N A 提取的定性定量分析：将提取的6 例胶质瘤组织的总R N A 进行1 ％琼脂糖凝胶电泳，其对应于2 8 s 和18 s 的两条带的亮度之比均为2 ：1 应用紫外分光光度法检测R N A 在2 6 0 n m 和2 8 0 n m 的0 D 值比值，计算R N A 浓度，结果见表1 - 3 。

证实提取的总R N A 高纯度、无明显降解，符合基因芯片试验要求表1 - 3紫外分光光度法对组织R N A 检测结果五、扫描结果：1 ．点样后及芯片处理后：采用共聚焦荧光扫描仪对芯片进行C y 5 荧光扫描，测定背景值，结果提示芯片基因点清晰，没有基因漏点、重迭、以及不正常荧光的情况，各芯片的背景值均匀，符合要求2 ．芯片杂交后：各芯片均清晰、均匀，无明显的彗星状拖尾现象，背景值均匀，无局部信号过强或过弱的情况，基因表达芯片的扫描图像、杂交结果可靠扫描图像见图卜3 2 7天津医科大学博士研究生论文图卜3 胶质瘤组织基因芯片杂交结果六、临床胶质瘤标本基因芯片数据聚类分析结果：将标本分为敏感和耐药两类，应用S A M 软件进行分析，在两类中表达有明显差异的基因可能与V M - 2 6 耐药或敏感性相关共筛选出有表达差异的基因2 1 个，其中表达上调的基因6 个，表达下调的基因1 5 个，见图1 —4 ，表卜4 ∞ 图卜4 基因芯片结果的聚类分析；天津医科大学博士研究生论文表1 —4 胶质瘤标本基因芯片数据聚类分析结果表达上调基囚N M0 1 4 4 3 0N M0 0 2 5 1 8N M0 0 1 9 7 7N 1 10 0 0 1 6 1N M0 0 4 9 6 4N M0 0 1 8 6 8C e lld e a t h —i n d u c i n gD F F A ’1i k ee f f e c t o rbN e u r o n a lP A Sd o m a i np r o t e i n2G l u t a m y la m i n o p e p t i d a s e ( a m i n o p e p t i d a s eA )G T Pc y c l o h y d r o l a s e1( d o p a —r e s p o n s i v ed y s t o n i a )H i s t o n ed e a c e t y l a s e1C a r b o x y p e p ti d a s eA 1 ( p a n c r e a t i c )表达下调基因N M0 0 6 6 2 4A d e n o v i r u s5E I Ab i n d i n gp r o t e i nN M _ 0 0 5 3 5 4J u nDp r o t o ’。

o n c o g e n eN M0 0 5 1 0 4B r o m o d o m a i nc o n t a i n i n g2P r o t e i n - k i n a s e ．i n t e r f e r o n —i n d u c i b l ed o u b l es t r a n d e dR N AA F 0 8 1 5 6 7 d e D e n d e n ti n h i b ’i t o rN M0 0 7 2 0 2Ak i n a s e ( P R K A ) a n c h o rp r o t e i n1 0N M0 0 0 9 5 4P r o s t a g l a n d i nD 2s y n t h a s e ( 21 k D ，b r a i n )N M0 0 0 6 9 0A l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e2f a m i l y ( m i t o c h o n d r i a l )N M0 0 1 7 8 8C D C l 0c e l ld i v i s i o nc y c l e1 0h o m o l o g ( S ．c e r e v i s i a e )N M0 01 6 5 9A D P —r i b o s y l a ti o nf a c t o r3N M0 0 4 6 1 5T r a n s m e m b r a n e4s u p e r f e m il ym e m b e r2N M0 0 6 2 7 2S 1 0 0c a l c i u mb i n d i n gp r o t e i n ，b e t a ( n e u r a l )N M0 0 4 2 2 6S e r i n e ／t h r e o n i n ek i n a s e1 7 b ( a p o p t o s i s —i n d u c i n g )A K 0 2 6 4 2 4G u a n i n en u c l e o t i d eb i n d i n gp r o t e i n ( Gp r o t e i n ) ，g a m m a2 眦0 0 5 4 7 0S p e c t r i nS H 3d o m a i nb i n d i n gp r o t e i n1N M _ 0 0 7 3 7 3S o c 一2s u p p r e s s o ro fc l e a rh o m o l o g ( C ．e l e g a n s )七、H D A C l 基因在胶质瘤组织中的表达情况：半定量R T - P C R 产物经电泳检测后，上调基因H D A C I 在6 例胶质瘤组织中均能扩增出位置正确的条带和B - a c t i n 条带，单因素方差分析，耐药组织和敏感组织间没有统计学差异。

具体光密度值见表卜5 ，耐药和敏感组织中各基因表达的比较见图1 - 5 ，标本1 、2 、3 为敏感组织，6 、7 、8 为耐药组织表1 - 5 耐药和敏感胶质瘤组织中H D A C I 基因表达量( ％)1236780 ．7 40 ．6 l4 3 ．1 28 ．9 33 5 ．8 74 9 ．6 5夭淬医科= ^ = 学博士研究生论文潍 薛 懿胶质瘤标本图卜56 例胶质瘤组织中H D A C I 基因的表达天津医科大学博士研究生论文讨论一、人胶质瘤细胞的原代培养及药物敏感性的评价：( 一) 原代培养的方法及条件的选择：原代培养是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养箱中培养的步骤，在所有操作步骤中，都要注意保持培养物及生长环境的无菌条件1 ．组织的取材：本研究中选用的胶质瘤是切除后经过冰冻切片确定了病理类型的肿瘤组织，选取没有坏死、肿瘤细胞较集中、活性较好的部位，而且胰蛋白酶消化后，镜下可见9 0 ％以上呈典型的肿瘤细胞特点：细胞体积大，外形多数不规则或呈多角形，部分呈圆形，其异常增大的体积和独特的外形与组织中浸润的炎性细胞和红细胞形成鲜明的对照；细胞核大，几乎占据整个细胞，核浆比例大。

与肺、肠等开放性器官不同，脑组织始终处于一个封闭的环境之中，术前被污染的可能性较小，并且，肿瘤组织离体后立即放置于4 ℃含有抗生素的培养基内，全部培养过程保证无菌操作，所以全部肿瘤标本在取材和培养过程中没有一例发生污染2 ．分离细胞的方法：从动物组织取材后，若要进行分散细胞培养，紧接着的工作就是将所取得的组织块分散成单个细胞，即制备细胞悬液方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螫合剂解离细胞法：虽然胶质瘤组织质地柔软，纤维性成分含量少，适合用机械解离法，但该方法对神经细胞的损伤很大，细胞的存活率低；螫合剂解离法又不适用于组织块的消化；酶学解离细胞法对细胞的损害程度较机械分散法为轻，尤其是对于分化程度高、形态不规整的细胞( 如成年动物神经组织细胞更如此) ，只要在消3 1天津医科大学博士研究生论文化过程中注意控制酶量( 酶浓度) 、作用时间长短以及酶处理温度就会取得较好的效果，所以蛋白消化酶解离胶质瘤组织是最好的选择胰蛋白酶解离细胞分为冷、热消化处理法冷处理法：胰蛋白酶消化液进行消化的温度为4 ℃，消化液浓度一般使用0 ．2 5 ％，消化时间延长。