gfp基因的克隆与表达.doc

基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及体现 专业：生工1001 姓名：刘会淼 3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的体现 实验措施; 通过度别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的措施把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行体现，再用IPTG诱导GFP基因体现，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功体现 1. 材料与措施：1.1.1 实验材料克隆菌E.coli DH-5a、体现菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、 Not Ⅰ1.1.2 仪器设备Eppendof离心机、电泳仪 、电子天平 、台式离心机 、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器 、紫外灯、生物干净工作台 、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头 、接种环 、酒精棉球 、灭菌枪头 、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃ 高压灭菌20 min。

LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；溶液Ⅰ 50 mL葡萄糖 50 mmol/LTris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存；溶液Ⅱ 100 mLNaOH 0.2 mol/LSDS 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；溶液Ⅲ 100 mLKOAc (5 mol/L) 60 mL冰乙酸 11.5 mLH2O 28.5 mL 121 ℃高压灭菌 15 min后置于0~4 ℃贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲灭菌的0.1 mol/L CaCl2，原则相对分子质量的DNA；溴乙锭（EB）储存液 0.5 µg/mL；LB/Kan（50 µg/mL）固体培养基；IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 ℃保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4 ℃；无水乙醇 ：放在0~4 ℃；RNase 母液：将RNase 溶于10 mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl 配成的试剂中，配成10 mg/mL的溶液，在100 ℃加热15 min，使也许溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20 ℃； 1.2措施： 1.2.1 大肠杆菌DH-5α (pEGFP-N3)染色体DNA的提取1.2.2、实验目的：掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。

1.2.3，器材：⑴，微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱⑵，消化缓冲液: CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml；其他试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl1.2.4实验原理生物的大部分或几乎所有ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中DNA在体内一般都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到后来的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以清除DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase清除RNA污染1.2.5、实验环节1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液  2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋 白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。

  3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀  4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟  5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移 至干净离心管6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中 7、加 1/10 体积3mol/L NaAc，及２.５ 倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀 －２０℃ 沉淀３０min1rpm15min，弃上清8、加70%乙醇1ml，轻轻混匀，1rpm15min，弃上清9、ＥＰ管放置于烘箱中烘干10、加３０ul TE或ddH2O溶解ＤＮＡ11、琼脂糖凝胶电泳检测 注意，实验室中一般用的1.5ml的EP管，可根据自己需要按比例调节加样量 DH-5α(pET-28a)的载体质粒也可根据同样措施提取1.3.1ＰＣＲ扩增1.3.2实验目的 １、学习ＰＣＲ扩增的基本原理２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作３、理解ＰＣＲ扩增的参数设计1.3.3实验原理１、聚合酶链反映 (Polymerase chain reaction，PCR)：运用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。

２、ＰＣＲ反映体系　　 引物、dNTP、 Mg２＋ 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer３、ＰＣＲ循环参数① 9５℃ 5min ② 9５℃ 30s ③ 5２℃ 30s ④ 72℃ 30s ⑤ goto② ２９times⑥ 72℃ 10min1.3.4器材1，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统2，Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液， MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液3，引物：1.3.5实验环节１、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反映体系 　　　　dd water 　　　　　　　　10.5ul 10×PCR buffer（不含MgCl2） 　　　　　　　3ul 25mM MgCl2 　　　　　　　2ul 10mmol/L dNTP 　　　　 　　　　　 1ul 10μmol/L 引物1 　　　　　　　　 1ul 10μmol/L 引物 2 　　　　　　　　 1ul 模板 　　　　　　　　　　　　　 1ul　 Taq酶 　　　　　　　　　　　　　 0.5ul 总体积 　　　　　　　　　　　 20ul２、在离心机中混匀。

３、ＥＰ管放入ＰＣＲ仪中，按照原理中的条件设立程序，进行ＰＣＲ反映４、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测1.4凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接1.4.1、实验目的1. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的措施2. 掌握DNA体外连接的措施1.4.2，实验原理1，DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与如下因素有关：DNA分子大小DNA分子构象琼脂糖凝胶浓度电泳所用电压电泳缓冲液2. 运用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA3. Taq酶参与PCR反映中，产物双链核酸中的3’端各多连接一种脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒1.4.3，仪器1，凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯，1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65℃ 水浴锅2，PCR产物，1×TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL marker1.4.4，实验环节 1，2%琼脂糖凝胶电泳2，在紫外灯下用干净的手术刀割下具有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量3，加入5个凝胶体积量的DR-Ⅰ Buffer 4，混匀 65℃加热融化凝胶块5，加入DR-ⅠBuffer量的1/2 体积的DR-Ⅱ Buffer, 当目的片段不不小于400bp再加入终浓度为20% 的异丙醇6，将上述溶液short后转移至spin coloumn中1rpm, 1min 弃滤液7，加入500ul RinseA 1rpm 30s 弃滤液8，加入700ul RinseB 1rpm 30s弃滤液9，同810，将spin coloumn安顿于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 1rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测11，链接反映（冰上操作）在一支0.2 ml EP管中加入如下试剂：纯化的目的DNA片段 4.5ulVector 0.5ul连接液 5ul 混匀 16℃连接过夜 1.5 DH-5α 和BL-21感受态细胞的制备1) 将0~4 ℃保存的DH-5α 和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。

2) 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 3) 取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min离心5 min弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min4) 弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存1.6 感受态细胞的转化1) 取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解。