影响脐血多能非造血成体干细胞分离的相关因素研究-2016年最新医学论文.doc

精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询影响脐血多能非造血成体干细胞分离的相关因素研究【摘要】 为了研究低血清条件下从脐血中分离多能非造血成体干细胞的相关影响因素，探索优化培养条件，通过不同培养液、接种密度、首次换液时间对脐血多能非造血成体干细胞生长的影响的比较，并以选定的条件对其培养扩增，进行免疫表型及诱导分化能力检测结果表明：在低血清条件下，DMEM/F12 培养液更适合于脐血多能非造血成体干细胞生长； 1×106／cm2 是原代培养的适宜接种密度，原代第 72 小时首次换液为最佳换液时问利用所选条件培养的细胞可在体外持续扩增，并具有良好的分化潜能结论：建立了人脐血多能非造血成体干细胞的体外优化培养条件，为其在组织工程方面的应用作出了新的探索 【关键词】 干细胞； 多能非造血成体干细胞； 脐血； 分离效率Related Factors Affecting the Isolation of Multipotent Non-hematopoietic Adult Stem Cells from Umbilical Cord Blood精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Abstract To investigate the related factors affecting the isolation of multipotent non-hematopoietic adult stem cells (MNASCs) from human umbilical cord blood in low serum (2%) condition，the isolation conditions were optimized and the yield of MNASCs was improved. MNASCs from human umbilical cord blood samples were isolated，and the effects of medium component，medium exchange time and initial plating density for isolation of MNASCs were studied. Then，the MNASCs were isolated and cultured in optimal condition，the surface antigen expression and differentiation potential of MNASCs were detected. The result showed that the medium of DMEM/F12 was better than IMDM and DMEM-LG for MNASCs culture in low serum condition. The optimal yield of MNASCs was obtained when mononuclear cells were cultured at a initial plating density of 1×106 cells／cm2 and the medium was exchanged to remove the nonadherent cells after 72 hours of inoculation. MNASCs isolated and cultured under the above-mentioned conditions maintained a homogenous morphology， high potential ability of expansion and differentiation. It is concluded that culture conditions with low serum defined in this study is 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询optimal for the successful isolation and expansion of umbilical cord blood MNASCs with high numbers for subsequent cellular therapeutic approaches.Key words stem cell; multipotent non-hematopoietic adult stem cell; umbilical cord blood; isolation efficiency近年来一些研究发现，脐血中存在具有多向分化潜能的非造血成体干细胞(multipotent non-hematopoietic adult stem cells，MNASCs)。

这类细胞可在体外培养扩增，并且能够分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种组织细胞 ［1，2］ 由于脐血干细胞具有资源丰富、增殖和自我更新能力强、免疫原性弱等优势，对其进行开发和应用将对干细胞组织工程及其应用具有深远意义目前从脐血中分离多能非造血成体干细胞多数仍然沿用Friedenstein 等建立的贴壁传代分离培养的方法，即利用不同细胞成分在塑料介质上黏附特性的差异，借助换液去除不贴壁的杂质细胞，传代纯化本研究对利用这一方法在低血清条件下分离脐血多精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询能非造血成体干细胞的相关影响因素进行了探讨，结果表明所用培养基种类、起始接种密度、初次换液时间等都是影响分离的重要因素材料和方法脐血多能非造血成体干细胞的分离和培养将脐血以 PBS 缓冲液 2 倍稀释后，用淋巴细胞分离液（相对密度为 1.077） ，400×g，离心 20 分钟，分离单个核细胞（MNC） ，洗涤后重悬于 DMEM/F12 培养液（Gibco BRL 公司产品）中，计数细胞，用含 2%胎牛血清（FBS，天津灏洋生物公司产品） 、40% MCDB-201（Gibco BRL 公司产品） 、10 ng/ml 人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，PeproTech 产品） 、1×胰岛素－转铁蛋白－亚硒酸钠（ITS，Gibco BRL 公司产品）的 DMEM/F12 培养液稀释，以1×106/cm2 的细胞密度接种于 6 孔板中。

置于饱和湿度、5％ CO2的 37℃培养箱中培养，72 小时后换液，弃去非贴壁的细胞，以后每周换液 2 次，第 14 天计数集落数，超过 50 个细胞计为集落当细胞达到 70％－80％融合时，以含 0.25％胰酶－0.1％EDTA 的消化液精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询消化，计为 P0 代细胞，传代培养在检验培养基的影响时，脐血MNC 分别以 IMDM、低糖 DMEM（DMEM－LG） 、DMEM /F12 培养基进行培养；检验接种密度的影响时，脐血 MNC 分别以1×105/cm2、5×105/cm2、1×106/cm2、2×106/cm2 密度接种；检验初次换液时间的影响时，分别于接种后 24、72、120 小时换液；其它条件均不变P2 代细胞集落形成及检测在各个培养条件下获得的 P2 代细胞以 10/cm2 密度接种于培养皿中，培养 14 天后，以 95％乙醇固定，加入 1％结晶紫染色，显微镜下计数集落，超过 50 个细胞计为集落结果以每 100 个细胞形成的集落数（%）表示细胞免疫表型分析收集培养第 3 代细胞，以 PBS 洗涤 2 次，分成每管含 2.5×105细胞，分别加入小鼠抗人 PE 或 FITC 标记的单克隆抗体精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询CD3、CD11a、CD29、CD31、CD34、CD73、CD45、CD44、CD105、CD144、CD49d、CD49e、CD62L 和 HLA-DR （均为 Becton Dickinson 公司产品）等 10 μl，阴性对照管加 FITC 标记及 PE 标记的兔抗鼠 IgG1各 10 μl，4℃避光孵育 30 分钟，以 PBS 洗涤后用 10 g/L 多聚甲醛固定，用流式细胞仪检测分析。

成脂、成骨及神经诱导分化及分化后鉴定消化体外扩增的第 3 代细胞，以 5×103/cm2 的密度接种于预先放置无菌消毒盖玻片的 6 孔板中，制备细胞爬片，每孔加 2 ml 上述分离培养液在细胞达到 60％-70％融合时，更换诱导分化培养基成骨诱导分化 诱导分化培养基为含有 10-7mol/L 的地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油，0.05 mmol/L 2-磷酸抗坏血酸（均为 Sigma 公司产品）和 10％ FBS 的 DMEM /F12 培养液，每周换液 2 次，培养 14 天取精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询出玻片，用 PBS 洗涤 1 次，70％酒精固定 10 分钟，行茜素红及 Von Kossa 染色，镜检，照相成脂诱导分化诱导分化的培养基为含有 10-6mol/L 的地塞米松，5 μg/ml 胰岛素，0.5 mmol/L 异丁基甲基黄嘌呤(IBMX) ，60 μmol/L 消炎痛（均为 Sigma 公司产品）和 10％ FBS 的 DMEM /F12 培养液，每周换液 2 次，培养 21 天取出玻片，用 PBS 洗涤 1 次，70％酒精固定10 分钟，以油红 O 染色，镜检、照相。

神经诱导分化诱导分化培养基为含 20 ng/ml 人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、20 ng/ml 人表皮生长因子（EGF） （均为 PeproTech 产品） 、0.5 μmol/L 全反式维甲酸（Sigma 公司产品）和 10％ FBS 的 DMEM /F12 培养液，每周换液 2 次，培养 14 天参照HistostainTM－plus 试剂盒(SP-9002，北京中山生物技术公司产品) 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询操作方法进行抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色实验对照用未诱导细胞爬片直接进行免疫组织化学染色收获诱导 14天细胞，TRIZOL (Invitrogen 公司产品)提取总 RNA，RT-PCR 检测神经巢蛋白（nestin）及中间神经丝（NF-M）表达nestin 上游引物 5’-AGGATGTGGAGGTAGTGAGA-3’，下游引物 5’-TGGAGATCTCAGTGGCTCTT-3’，NF-M 上游引物 5’-GAGCGCAAAGACTACCTGAAGA-3’，下游引物 5’-CGACTCTAGCTCGATGCTCTTG-3’。

统计学处理多组间的比较采用 Kruskal-Wallis 非参数估计，两样本间的比较采用 Mann-Whitney 秩和检验结果培养基种类对分离效果的影响精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询在低血清条件下，3 种培养液中均可有贴壁细胞出现，在形态上这些贴壁细胞没有明显差异在随后的培养过程中，DMEM/F12 培养液中的细胞生长迅速，在第 14 天时每 106 MNC 形成的集落中位数为1.35 个（1.1-1.5 个） ，而在 IMDM、DMEM-LG 培养液中的细胞多数死亡，仅少数形成集落，每 106 MNC 形成的集落中位数分别为 0.25 个（0.1-0.4 个）和 0.05 个（0-0.2 个） ，明显低于 DMEM/F12 培养液（P 0.01） 在继续培养过程中，DMEM-LG 培养液中的细胞消化传代后生长减慢，不能生长至 P2 代IMDM 培养液中的细胞生长不超过P2 代，传至 P2 代后所获得的细胞中位数为 0.79（0.6-0.95）×106，所获 P2 代细胞不能形成集落。