粘质沙雷氏菌脂肪酶发酵优化.pdf

发酵工程学科的进展 ——第四次奎国发酵工程学术讨论套论文集 粘质沙雷氏菌脂肪酶发酵优化 龙章德，潘江，许建和 ( 华东理工大学生物反应嚣工程国家重点宴验室，上侮2 0 0 2 3 7 ) 摘要：对牯质沙雷氏苗产胞外脂肪酶进行了发酵产酶优化在描瓶培养中对发酵培养基 组分进行优化，以糊精为碳霖，牛内膏和硫破铵为氟源，吐温一8 0 作为诱导剂兢果最佳．提 高吐湿- - 8 0 的浓度，脂肪辟产量显著提高将吐温浓度由0 提高到1 0g ／L ，脂肪癣产量由 2 4 0 U ／L 提高到3 3 4 0 U ／L 吐温浓度为1 0g ／L 时．脂肪酶比活最商，约6 4 0u ／g 细胞干重 当摇瓶的装液量由2 0 ％降1 匠到1 0 ％酶的产量大幅度增长．提高摇床转速也能促进脂肪酶 生产，尽管细胞生长壁轻截抑幸I ，结呆表明氧供应能力的提高是脂肪碎产量上升的重要因 素在5L 发酵罐中进行了脂肪酶发酵生产，吐温- - 8 0 浓庹限定为2 ．0g ／L ，I ；c 避免发酵过 程中严重产泡．通过控制搅拌转速维持培养液的溶氧浓度不低于2 0 ％，发现将通气速事由 0 ．5 ”m 提高刊1 ．0v v m 可获得较高的酶产量，选1 1 。

0 6 0U ／L ． 昌皂键词：牯质涉冒氏菌；脂肪酶；发酵} 优化 引言 脂肪酶( L i p a s e ，E C3 ．1 ．1 ．3 ) ，全称为三酰基甘油酰基水解酶，在自然界广泛分布， 比如动物肝脏、植物种子以及微生物中，都有其存在脂肪酶广泛应用于食品、医药、精 细化学品，表面活性剂以及废水处理工业中口_ 3 ] ．脂肪酶也是有机合成中应用最广泛的 酶，能化学选择性、区域选择性或立体选择性地催化羧酸酯的水解或在有机溶剂中催化 酯的合成或转酯化反应n _ 7 ] 微生物脂肪酶具有较高的催化活力和稳定性，并且可以通 过微生物发酵大量获得，广泛应用于生物化工行业 我们实验室通过定向筛选，获得一株粘质沙雷氏菌E C U1 0 1 0 ．该菌所产的胞外脂肪 酶能催化消旋对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[ ( 土) 一M P G M ] 的对映选择性水解拆分，E 值 大于1 0 0 Ⅱ] ，拆分剩余的光学纯底物( 2 R ，3 S ) - ( - ) - M P G M 是心血管药物盐酸地尔硫卓合 成的重要中间体o _ 1 “吐温一8 0 ( 聚氧乙烯山梨醇单油酸酯) 是一个非离子表面活性 剂，在某些脂肪酶发酵中可作为碳源o “圳。

在先前的研究中，发现吐温- - 8 0 有益于粘质 沙雷氏菌E C U1 0 1 0 脂肪酶的发酵生产[ B 】但是大量的吐温一8 0 导致发酵过程中急剧 产泡，难以控制；并且菌体对初始堵养基中添加的吐温- - 8 0 利用缓慢，发酵结束后培养基 中残留的大量吐温- - 8 0 给脂肪酶下游应用带来困难在本文工作中，以低浓度吐温一8 0 作为产酶诱导荆，在摇瓶中对培养基碳氮源组分进行了优化，并进一步在5 一L 发酵罐中 考察了氧气供应对粘质沙雷氏菌发酵产酶的影响 1 材料与方法 1 ．1 菌种、培养基和培养条件 第四次全国发酵工程学术讨论会 粘质沙雷氏菌E C U1 0 1 0 是一株革兰氏阴性菌，现在保存于中国普通微生物保藏中 心，序列号为C G M C C1 2 1 9 实验室菌种保藏于4 ℃，琼脂斜面上 种子培养基：蛋白胨1 0g ／L 、酵母膏5g ／L ，另外添加无机盐( M S M ) ：K H 2 P O ·2 ．0 g ／L 、N a C l0 ．5g ／L 、M g S n ·7 H z O0 ．5g ／L 以及F e S O t ·7 H 2 0o ．O lg ／L ，灭菌前用 N a O H 调节p H 为7 ．0 。

琼脂斜面培养基：与种子培养基相同，另外添加2 0g ／L 琼脂 发酵培养基：含有与种子培养基相同的无机盐组分以及其它碳氮源组分．将在相关 部分予以具体描述 1 ．2 摇瓶培养 取一环斜面菌种，接种到盛有3 0m 1 种子培养基的2 5 0m l 摇瓶中，在3 0 ℃和1 5 0 r p m 振摇培养1 2h 后，转接到发酵培养基中摇瓶发酵培养用2 5 0m l 摇瓶进行，按培养 基2 ．5 ％( v ／v ) 的接种量接种，随后在3 0 ℃和1 5 0r p m 振摇培养，每隔4h 取样检测样 品在4 “ 0 ，1 0 ，0 0 0 ’g 离心1 5 m i n ，取上清酶液进行分析 1 ．35 - - L 发酵罐分批培养 用5 0 0m l 摇瓶进行种子培养，装液体积为1 0 0m l 取一环斜面菌种，接种到种子培 养基中，在3 0 ℃、1 5 0r p m 振摇培养1 2h 发酵罐分批培养在5 一L 搅拌发酵罐中进行，装液体积为3 ．0L 发酵培养基；糊精 1 5 ．0g ／L 、牛肉膏1 0 ．0g ／L 、( N H t ) 2 S O 5 ．og ／L 以及无机盐组分，p H 调节为7 ．0 。

吐 温- - 8 0 ( 3 0g ／L ，2 0 0m 1 ) 在细胞生长的对数期末( 大约8h ) 进行流加，流速为5 0m l ／h 吐温- - 8 0 的终浓度为2 ．0g ／L 按2 ．5 ％( v ／v ) 的比例接种，培养温度恒定为3 0 “ 0 ．初始搅拌转速为4 0 0r p m 通过 调节转速控制发酵液的溶氧浓度 1 ．4 分析方法 细胞浓度用分光光度法测定，将发酵液适当稀释后，测定6 0 0r i m 波长处的吸光度值 0 D 6 根据预先测定的标准曲线换算成细胞干重 胞外脂肪酶活力测定：以对硝基苯酚乙酸酯( p —n i t r o p h e n o la c e t a t e ，p N P A ) 为底物， 通过分光光度法进行测定取1 0 0v l 适当稀释的酶液，加入到2 ．8 7m l 磷酸钾缓冲液中 ( 1 0 0 m M ，p H7 ．o ) ，在3 0 ℃保温3 m i n ，加入3 0p 1p N P A 的D M S O 溶液( 1 0 0r a M ) 启动 反应读取4 0 5n m 波长下吸光度的变化用水替代酶液作为空白对照 1 个脂肪酶活力单位定义为：在上述条件下每分钟水解对硝基苯酚乙酸酯生成1 ．0 p m o l 对硝基苯酚所需的酶量。

2 结果和讨论 培养基组分，比如碳源、氮源、无机盐、生长因子以及培养条件，如培养温度、p H 、搅拌 转速和溶氧浓度都会极大地影响脂肪酶的发酵生产一些化台物，如油脂、脂肪酸、糖酯 ( 如吐温- - 8 0 ) 和胆酸盐等能诱导脂肪酶的表达本文中，我们用吐温- - 8 0 作为产酶诱导 剂促进脂肪酶的生产对培养基组分进行了简单优化，并就培养过程中氧气供应对粘质 龙章德等：粘质抄雷氏菌脂肪酶发酵优化2 7 3 沙雷氏菌E C U1 0 1 0 发酵产脂肪酶的影响进行了考察 2 ．1 摇瓶培养中吐温- - 8 0 浓度对细胞生长以及脂肪酶生产的影响 在摇瓶培养中，使用不同浓度的吐温一8 0 ，考察其对细胞生长以及脂肪酶生产的影 响，结果列于表1 中当吐温一8 0 的浓度从0 增加到1 5g ／L ，细胞最大于重从3 ．7g ／L 提高到6 ．0g ／L 当吐温一8 0 的浓度低于1 0g ／L ，随着培养基吐温浓度的提高，脂肪酶 的产量从2 4 0 增加到3 3 4 0U ／L ，但达到最高脂肪酶产量的时间相应延迟继续提高吐 温- - 8 0 的浓度，脂肪酶产量下降根据实验结果，吐温一8 0 极大地影响细胞生长以及脂 肪酶的生产。

摇瓶培养中最佳吐温一8 0 浓度为1 0g ／L 裹1畦温一8 0 浓度对粘质沙冒氏菌E C U1 0 1 0 生长以殛胞外脂肪酶生产的影响 培养基组分1 0g ／L 糊精、2 0g ／L 酵母膏、无机盐以及不同浓度的吐温一8 0 摇瓶 装液量为3 0 m l 2 ．2 摇瓶装液量以及摇床转速对细胞生长以及脂肪酶生产的影响 氧气供应对粘质沙雷氏菌细胞生长以及脂肪酶的生产有较大影响低装液量能促 进摇瓶溶氧供应，丽提高摇床转速能提高摇瓶中的溶氧传递速率如图1 A 所示，当培养 基装液量从1 0 ％提高到2 0 ％．细胞干重差异较小，而当转速从1 5 0 提高到2 0 0r p m ，细胞 生长有轻微抑制另一方面，提高转速、降低培养基装液量，对于脂肪酶生产有利，脂肪 酶产量显著提高( 图1 B ) 当摇瓶培养在1 0 ％装液量和2 0 0r p m 转速下进行，脂肪酶产 量达8 3 7 0U ／L ，脂肪酶比生产量为1 3 1 7 士3 5U ／g 细胞干重结果表明溶氧供应可能是 摇瓶培养中限制粘质沙雷氏菌E C U1 0 1 0 脂肪酶生产的关键因素 驻澶蕾( v ／v 用插床转速( r 刚 ||萋 固1 摇瓶装液量以及摇床转速对粘质沙冒氏菌细胞生长( A } 以殛胞外脂肪酶生产的影响( B ) 培养基组分：1 0g ／L 糊精、2 0g ，L 酵母膏、l og ／L 畦温- - 8 0 以殛无机盐 2 ．2 碳氮源的组合优化 测试了几种碳源，包括葡萄糖、糊精、淀粉、麦芽糖、蔗糖以及几种有机氮源，包括酵 2 7 4第四次全国发酵工程学术讨论会 母膏，牛肉膏、蛋白胨、玉米浆．考察它们对粘质沙雷氏菌细胞生长以及脂肪酶生产的影 响，并对其进行组合优化。

细胞生长与碳源类型密切相关，以葡萄糖作为碳源．细胞生长 以及脂肪酶生产都较差以蔗糖作为碳源，细胞浓度最高，以糊精为碳源，细胞生长中 等，但脂肪酶的产量较高氮源对细胞生长没有显著影响，但对脂肪酶产量有较大影响， 用牛肉膏作为唯一氮源，酶产量最高在此结果基础上，考察了无机氮源( N H ．) S O 的 影响无机氮源对细胞生长没有显著影响，但脂肪酶的产量与N H + 的浓度正相关 ( N H ．) ：S O 浓度为5g ／L 时．脂肪酶产量最高，比未添加( N H ．) z S O , 的对照组高2 9 ％ 设置吐温- - 8 0 浓度为1 0g ／L ，( N H ．) z S O , 浓度为5g ／L ，就糊精和牛肉膏浓度对细胞生 长以及脂肪酶生产的影响进行了考察，当糊精浓度为1 5g ／L ，牛肉膏浓度为1 0g ／L 时， 脂肪酶产量最高，达1 2 8 0 0U ／L 这个碳氮源配比随后用于5 一L 发酵罐的放大培养中 2 ．35 - - L 发酵罐中的脂肪酶生产 微生物发酵培养过程中，发酵液的氧气供应对细胞生长以及产酶有显著影响o ““] 在先前摇瓶实验中，我们发现粘质沙雷氏菌E C U1 0 1 0 的生长及其脂肪酶的生产很可能 受氧供应的限制，可通过发酵罐中改善氧传递速率而解决。

摇瓶实验结果表明吐温一8 0 的浓度为1 0g ／L 时脂肪酶产量最高但为了避免发酵过程中大量产泡以及发酵结束后 培养基中残留的大量吐温- - 8 0 影响下游应用，将其浓度降低为2g ／L 考察了培养过程 中氧气供应对粘质沙雷氏菌E C U1 0 1 0 发酵产脂肪酶的影响，通过调节转速维持最低 D O 水平以及提高通气速率来改善氧气供应 O401 21 6 发酵啪J ∞ § ■ § 普 田2 溶氧饱和度( A ) 对轱质沙霄氏菌细胞生长以爰脂肪酶生产的影响CB ) A ·发酵过程中溶氧饱和度的变化．( o ) 未控制溶氯饱和度·( ●) 控制溶氧饱和度≥2 0 ％．B t ( r ▲) 细胞干 重I ( 口．■) 脂肪酶产量．空心代表未拉制溶氧饱和度，实心代表控制溶氧饱和度≥2 0 “培养基组分·1 5 ∥L 翱柑，l Og ／L 牛内膏，5g ／L ( N H 4 ) 2 S 0 4 以及无机盐．大约在8h 时流加吐温( 3 0g ／L 2 0 0 m 1 ) ．流速为5 0 m l ／ h ．吐温终浓度为2 ．0g ／L 第一批发酵在3 0 0 1 2 ．。