实验八DNA的显示Feulgen反应ppt课件.ppt

实验八：DNA的显示——Feulgen反响•【课前预习】•1．Feulgen反响的实验原理和关键步骤是什么？•2．在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进展洗片？•【目的要求】•1．熟习并掌握Feulgen反响的原理及其实验操作方法•2．对细胞的免疫组化研讨方法有初步的认识•【根本原理】【根本原理】•FeulgenFeulgen反响〔反响〔Feulgen reactionFeulgen reaction〕是〕是显显示示DNADNA的最典型的的最典型的组织组织化学反响，化学反响，为为学者学者FeulgenFeulgen和和RossenbeckRossenbeck于于19241924年年发发明，明，简简称称为为FeulgenFeulgen法因对对DNADNA的的显显示反响具有高度示反响具有高度专专注性，故常被用来注性，故常被用来显显示示细细胞内胞内DNADNA的分布情况的分布情况•自自FeulgenFeulgen等等发发明明该显该显示示DNADNA的的FeulgenFeulgen反响法以来，其作反响法以来，其作用机制也久用机制也久经经研研讨讨和和讨论讨论，，现现已已获获得一致意得一致意见见。

其其详细详细反反响原理是，响原理是，标标本本经经稀稀盐盐酸水解后，酸水解后，DNADNA分子中的分子中的嘌嘌呤碱基呤碱基被解离，从而在核糖的一端出被解离，从而在核糖的一端出现现了了醛醛基SchiffSchiff试剂试剂中的中的无色品无色品红红可与可与醛醛基反响，构成含有基反响，构成含有醌醌基的化合物分子基的化合物分子, , 因因醌醌基基为发为发色色团团，故可呈，故可呈现现出紫出紫红红色也就是色也就是说说, DNA, DNA经经稀稀酸水解后酸水解后产产生的生的醛醛基，具有复原作用，可与无色品基，具有复原作用，可与无色品红结红结合合构成紫构成紫红红色化合物，从而色化合物，从而显显示出示出DNADNA的分布其反响机制的分布其反响机制如以下如以下图图所示•2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO32HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3•DNADNA经经温温稀稀酸酸水水解解，，其其上上的的嘌嘌呤呤碱碱和和脱脱氧氧核核酸酸之之间间的的键键翻翻开开，，使使脱脱氧氧核核糖糖的的一一端端构构成成游游离离的的醛醛基基，，这这些些醛醛基基在在原原位位与与SchiffSchiff试试剂剂中中的的无无色色品品红红反反响响，，构构成成紫紫红红色色的的化化合合物物，， 因因此此FeulgenFeulgen反反响响中中，，显显示示紫紫红红色色的的细细胞胞部部位位，，即即标标志志有有DNADNA的的存存在在。

FeulgenFeulgen反反响响现现仍仍广广泛泛用用于于DNADNA的的定定性性定定位位和和定定量量的的显显微微测测定技定技术术上•  •【【实验实验用品】用品】•1 1．器材．器材 显显微微镜镜、立式染色缸、水浴、立式染色缸、水浴锅锅•2 2．．资资料料 香柏油，擦香柏油，擦镜纸镜纸，盖玻片，，盖玻片，载载玻片玻片•3 3．．试剂试剂•1 1〕〕schiffschiff氏氏试剂试剂 将将0.5g0.5g碱性品碱性品红红置入三角置入三角烧烧瓶内沸瓶内沸腾腾的的蒸蒸馏馏水中，水中，时时摇动时时摇动玻璃瓶，煮沸玻璃瓶，煮沸5min5min使之充分溶解，冷使之充分溶解，冷却至却至5050℃℃时过滤时过滤，参与，参与10ml 1mol/L HCl10ml 1mol/L HCl，冷至，冷至2525℃℃时时，参，参与与0.5g0.5g偏重偏重亚亚硫酸硫酸钠钠〔〔Na2S2O3Na2S2O3〕无水〕无水亚亚硫酸硫酸钠钠〔〔NaHSO3NaHSO3〕，在室温冷暗〕，在室温冷暗处处至少放置至少放置24h24h〔有〔有时时需需2~32~3天〕，天〕，使其使其颜颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处处，最好保管于，最好保管于4 4℃℃冰箱中〔可保管数月或更冰箱中〔可保管数月或更长时间长时间〕。

在运用前参与〕在运用前参与0.5g0.5g活性碳活性碳, , 摇摇1min, 1min, 用粗用粗滤纸过滤滤纸过滤，，滤滤液液应为应为无色；假无色；假设设液体液体颜颜色色变为变为粉粉红红色，便不能再用色，便不能再用•2 2〕〕亚亚硫酸水〔洗硫酸水〔洗涤剂涤剂〕：用〕：用200ml200ml普通自来水〔不要用蒸普通自来水〔不要用蒸馏馏水水, , 以免引起以免引起误误差〕、差〕、10ml 10%10ml 10%的偏重的偏重亚亚硫酸硫酸钠钠水溶液水溶液和和10ml 1mol/L HCl10ml 1mol/L HCl，三者在运用前混合，，三者在运用前混合，现现用用现现配•3 3〕〕1mol/L HCl1mol/L HCl〔水解用〕：取〔水解用〕：取82.5ml82.5ml比重比重为为1.191.19的的盐盐酸加酸加蒸蒸馏馏水水1000ml1000ml即成〔即成〔应应将将盐盐酸酸渐渐渐渐参与水中〕参与水中〕【方法步骤】•【实验结果】• 细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反响，它不但反响出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反响的深浅，来判别DNA的相对含量细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反响；但在有些资料的细胞质中，DNA也会出现阳性反响。

小鼠肝切片Feulgen染色大蒜根尖Feulgen染色【实验报告】•1．绘图表示Feulgen反响的染色结果•2．总结Feulgen反响染色结果的影响要素。