河北阳原县姜家梁遗址新石器时代人骨DNA的研究.pdf

考古年第期考古与科技 河北阳原县姜家梁遗址新石器 时代人骨的研究 吉林大学考古实验室 关键词线粒体姜家梁新石器时代居民系统树母系氏族社会父系氏族社会 前言 姜家梁新石器时代墓地位于河北 省阳 原县东城镇西水地村东的一个山丘顶部 南 临桑干河 高出河床多米 墓地周围受地 表径流冲蚀严重 文化遗存也受到一定程度 的破坏 该遗址地层堆积非常简单 在耕土 之下 即显露出墓穴或房址 填土均为黑灰色 五花土 墓葬和房子直接建于更新世灰绿色 泥河湾层之上 所发现的座墓葬分布井 然有序 大致为东西向呈排展布 墓向基 本一致 均朝北略偏西 墓葬之间无相互打 破关系 从墓葬的分布规律 形制 葬式和随葬 器物可知 这批墓葬的文化性质较独特 具 有浓郁的地方色彩 其文化面貌和邻近的蔚 县三关遗址第三期遗存关系较密切 其主要 文化 内涵和河北南部同一时期的文化遗存 差异明显 属于不同的文化系统 而与燕山 南麓及山前地带分布的雪山一期文化 和西 辽河流域的小河沿文化存在某种联系 时代 大致处于仰韶 文化时期之末或仰韶文化向 龙山文化的过渡阶段 由于姜家梁遗址古 人群所处的时代较为特殊 故对其社会属性 的判断 即应该是属于父系社会还是母系社 会 一直为考古学家所关注 这里我们运用 分子生物学的方法对这一问题进 行了较为 细致的研究 力图得出明确的结论 同时为 考古学相近问题的解决提供新的思路与方 法 古生物遗体包含三种 有 系统分析价值 的信息 即形态学信息 化学信息生物的代 谢产物和一般的化学分子和遗传信息保 存有一级结构的生物大分子 即信息的载体 总考古 1994 2012 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 脱氧核糖核酸分子 在一定条件下保 存的古生物遗体 可能含有完好的片 段 能够用来研究其中的遗传信息 这在生 物学和考古学研究上都有着重要的价值 样品中的遗传学信息主要存在于骨细 胞和头发细胞中 但是由于年代久远 遗体中 的一般都遭到了严重的破坏 对于遗 骨样品中古的分析表明 在人 或动物死亡后 的短时间内 就很快被降 解到大约几百个碱基对的水平 而在以后相 当长的时间内的降解则非常缓慢 基 本仍能保持几百个碱基对完整的水平 而 且 样品保存地点的环境条件也是至关重要 的 比如 对于一些被保存在唬拍里或冰封 的样品 即使距今有几百万年以上 仍可以 从中提取出古 一般来说 寒冷 干燥 和隔绝空气 对于样品的保 存是大有好处 的 目前的研究认为 古的损伤主要 有两种原因水裂解损伤 将导致脱嚓吟 和脱嗜陡 从而导致碱基的失活氧化损 伤 这是直接来自于离子辐射对的影 响 可以导致碱基被修饰 而其他的机制 如 碱基化 辐射对于埋在地下 的考古样品 的影响则较小 现在 一般采取气相色谱 质谱联机的方法来检测和大致定 量不同类型 的碱基氧化损伤 进而分析损伤 的程度以及确定能否从样品中提取古 用于生物学的研究 古分子的研究工作能够 为考古 学家提供很大的帮助 解决一些考古学上悬 而未决的问题 从一个崭新的角度对古人群 或现代人群的起源 进化 迁移 融合和消逝 等提出极具价值的观点 年 等人成功地从灭绝 了 年的马科动物斑驴风干 的皮 中提取和分离出线粒体片 段 经与斑马 马 牛及人的对应线粒体 片段 进行比较 发现斑驴的线粒体 与现存的斑马很接近 而与马 第期 科其他种类的则相差较远 这是科学 界 首 次将 古应 用 于分子系统 学分 析 其后不久 等人从古埃及木乃伊 的组织 中提取并克隆了片段 以后 又相继报道 了从不同年代的古人类和古动 物 的骨骼和组 织中提取和分离出古 分子的情况 例如 从保存于唬拍中的距今 已有 亿年的象鼻虫中提取分离出两个 长度分别为和的片段 部分基因 从距今约年 的古人骨 中提取分离出几个线粒体控制区 片段 从绝灭的地赖的粪 便中提取出几种植物 进而 了解到这 种动物的饮食结构 研究者最初的工作尝试都是用分子 克 隆的技术来研究古 然而 由于生物机 体的变质降解以及在漫长的地质年代中古 被严重地损伤和修饰 这样就导致了 克隆古的两个困难一方面 由于被 损坏 的古不能在菌体内复制 从而使 克隆效率极低另一方面 由于被损坏的古 在菌体内得到错误修复 因此致使古 信息失真 年 巨巨 等首先将技术应 用到古的研究 中 从距今大约 年前的人颅骨中提取出个碱基对的线粒 体 此后 人们进行的古方面 的研究几乎都是基于技术 在古 的研究 中迅速取得了一些重要的进展 这主 要是由于以下几方面原因一是技术 所需要的含量微少二是可以保证所 得信息的准确性三是方法简单 快捷 目前 研究者大都是 由线粒 体中提取出完好的古片段来 扩增 因为在细胞 内存在的拷贝数 较多 一 所以提取容易 一些 而且 最近的一些实验基本上是集 中 于的调控区上 这是 因为相对于其 他部位来说 的调控区变异更快 总 1994 2012 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 对于研究进化水平更为有效 虽然一般来说 古样品中含量与 样品年代的关系并不是很大 而主要是与被 保存的条件相关 但是对于年代特别久远 的 样品 即使其被保存条件很好 其中 也会降解到现代技术所不能分析的水 平 指 出 对于 目前的技术来说 可 能分析的最古老的样品 大约能到距 今 一 年前 而更古老的样品则很 难成功地提取出 然而对于一些特殊 条件下保存的样品 有研究者声称 即使是 亿年前 也能够将提取出来 当然 对此提出质疑 认为仅仅是内源性 氧化反应也不会允许这么古老 的样品存在 完好的 显然 提取的的量是 很微少的 无法进行进一步的分析 因此 一 般采用技术进行扩增 聚合 酶链式反应技术的原理是在体外模拟生物 体内的过程 遗传物质在代间的遗传 是由于 生物体 内存在一套复制并使 后代具有和上 一代完全相 同的分子 的机制 在体外 把少量的模板 聚 合酶 引物及各种脱氧核糖核昔酸加入一个 体系 中进行反 应 扩增出和模板 相同 的 分子就是技术 这一技术的基本 步骤如下的热变性引物的退 火聚合酶作用下 的引物延伸 循环往 复 从而在短时 间内使分子扩增 以上 以便于进一步的研究工作 一 材料和方法 一材料 本文所用的样品采自姜家梁遗址 我们 着重对个合葬墓 中不 同个体的序 列进行了分析 表一 二试剂与仪器 主要有异硫氰酸肌 一 引物表二 总 表一姜家梁遗址人骨样品 合合葬墓合葬墓合葬墓合葬墓 女女男男左男男下女女 女女中女女右男男上男男 女女男男男男 级 聚合酶 纯 化试剂 盒 叹 克隆试剂盒 循环测序试剂盒 印 仪 凝胶成像仪 手动测 序仪 三方法 样品的制备在 无 菌超净台中进 行 戴一次性手套和无菌套袖 先用毛刷除 去骨样品表面污垢 再用灭菌石英砂粉打磨 骨样品表面 然后用毛刷清理 以无菌手术 刀刮去骨样表面 一 毫米 将处理好的骨 头样 品放在研钵中 倒人液氮 使用适当的 力量敲击骨样 研磨过程 中不断补加液氮 反复研磨直至骨样成为粉末 提取提取过程参照年 所设计的程序 具体步骤如下 在装有骨粉的离心管中加人 提取缓冲液 一 一 用封口膜封 严管 口 于 水浴中振荡一 小时 吸取川 黄色上清液移人另外的 离心管中 加入 拜 提取缓冲液和 拼 二氧 化硅悬浊液于此离心管 振荡 重悬 又 离心 弃上清液 加人清洗缓冲液 一 振荡 重悬 离心 弃上清液 重复一次 加入的乙醇 振荡 重悬 离心 弃去上清液 重复一 考古 1994 2012 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 表二扩增所用的引物 位位置置 弓物 序列列长度参考文献献 一一 本研究究 一 一 本研究究 一一 本研究究 一一 本研究究 一一 等 一一 等 一 一一 等 一 一 一 等 或后 的数字表明其 端的位置 参照 等公布的现代人的序列勺 次 加人丙酮 振荡 重悬 离心 弃去上清液 沉淀物在 干燥 分钟 用 拌 玩进行洗脱 得到的分子溶液于 零下 保存 聚合酶链式反应以上提取所 得到的溶液中含量甚微 需采用 方法扩增片段 本实验所用引物 见表二 过程如下第一阶段加人 一 和 拜 引物 加 人玫至川 反应开始 热启动 然后加人单位的聚合酶 扩增个循环 每一个循环过程包括 热 变性 退火 延伸 第 二阶段的扩增反应是在第一阶段基础上进行 从第一阶段的反应液 中吸取川 作为第二阶 段扩增的模板 除聚合酶加 量为单位外 其他组分相同 产物在零下 叱保存 琼脂糖凝胶电泳分析及纯化用 电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶 含澳化乙锭 拌 置于盛有 电泳缓冲液的水平电泳槽中 对扩增物 进行电泳分析 电压为 第一泳道加入 知产 其余每 个上样孔加人 外产物与 拼 凝胶 加样缓冲液 电泳 一 后 紫外 光透射观察 做记录 并照相 然后 用无菌手 术刀片将特异性条带切下 并且使用 进行纯化 克隆克隆是一种快速的 一步到位地把产物直接插人到质粒载体 的方法 其步骤可简述如下 将产品连接在 一 质 粒载体上 将连接好的 环 状质粒 转 化到 大肠杆菌中 使大肠杆菌在 汉 一 培养基中生长 挑取白色菌斑进行增殖 提取质粒 纯化质粒 序列测定测序引物为正 反公共测序引物 应用循环测序法进行 测序 所用试剂盒 二 结果 一 电泳结果 图 一 和 图二分别为和 片段的电泳结果 其中 第一泳道都是 第十二泳道为空白提取组 第十三泳 道为参照组 第二至第十一泳道为所检 测的样品 如图标所示 图三为 片段的电泳结果 第一泳道为 第十泳 道为空白提取组 第十一泳道为参照 组 第二至第九泳道的样品如图标所示 空白 提取 组和参照组都没 有扩 增 出任何 第期 总 1994 2012 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 女女中女左男下女 女男 男右男上男 振 洲 川 艺 勺 图一的扩增产品的电泳结果 第一泳道为 第十二泳道为空白提取组 第十三泳道为参照组 第二至第十一泳道分别为样品 女 女 女 男 中女 男 左男 右男 下女和上男 女女中女左男下女 女 男男右男上男 至 图二扩增产品的电泳结果 第一泳道为 第十二泳道为空白提取组 第十三泳道为参照组 第二至第十一泳道分别为样品 女 女 女 男 中女 男 左男 右男 下女和上男 女男男右男 飞 女交 女 中女左男 深冬 一 月叫户洲 山 勺 石 图三扩增产品的电泳结果 第一泳道为 第十泳道为空白提取组 第十一泳道为参照组 第二至第九泳道分别为样 品女 女 女 男 中女 男 左男 右男 总考古 1994 2012 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 产物 因此在样品的处理 的提 取和扩增中 都没有污染现代人的 二的测序和分析 在本次实验所检测 的个样品中 共 有巧个位点与年等公布的 现代人的序列不一致表三 其中巧个变 异中个是嗜陡间的转变 个是嗓吟间 的转变 没有嗜吮和嗓吟间的颠变 此外 构建了一个包含个样品的 序列 的种系树图四 使用的方法是最 大 可能性法 通过软件进行计算 通过观察这个种系树 我们发现 姜家梁遗 址的个序列被分为组工 每组恰好对应一个合葬墓 其中工 组都具 有 很高的值的支 持 但是在软件分析的个中 个是无法解析的 这表 明该种 系树只是概括反映了个样品的序 列间的进化关系 另外 我们计算这个 序列 的异源性参数 标准 差为 异源性参数是序列变异 男 男 女 一 中日 翔 气露夏 左男孙 不瓜 下女 图四用最大可能性的方法构建的姜家梁线粒体序 列的种系树 此树的枝条分为四组 且 是一 非洲人。