大鼠皮质醇(Cortisol)ELISA试剂盒说明书.docx

大鼠皮质醇（Cortisol）酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂盒仅供体外研究使用！预期应用ELISA法定量测定大鼠血清、血浆或其它相关生物液体中皮质醇（Cortiso®量实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗皮质醇（Cortisol）抗体的微孔中依次加 入标本或标准品、生物素化的抗皮质醇（Cortisol）抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用 底物TMB显色TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色 颜色的深浅和样品中的皮质醇（Cortisol）呈正相关用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度ELISA法试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板：一块（96孔）2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上， 然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为180 ng/ml，做系列倍比稀释（注：不要直接在板中 进行倍比稀释）后，分别稀释成 180 ng/ml，90 ng/ml，45 ng/ml，22.5 ng/ml，11.25 ng/ml, 5.63 ng/ml，2.82 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。

如配制90 ng/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml ） 180 ng/ml的上述标准品加入含有 0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推3. 样品稀释液：1x20mlo4. 检测稀释液A： 1x10ml5. 检测稀释液B： 1x10ml6. 检测溶液A：仆1205 （1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算 好的每次实验所需的总量配制（100叫孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml如 10pl检测 溶液A加990』检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制7. 检测溶液B： 1x120pl/瓶 （1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释稀释方法同检测溶 液A8. 底物溶液：1x10ml/瓶o9. 浓洗涤液：1x30ml/^^，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍10. 终止液：1x10ml/瓶 （2N H2SO4）o11. 覆膜：5张12. 使用说明书：1份自备物品1. 酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）2. 微量加液器及吸头，EP管3. 蒸馏水或去离子水，全新滤纸标本的采集及保存1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4°C过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可 检测，或将标本放于-20 C或-80C保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15 分钟，或将标本放于-20 C或-80C保存，但应避免反复冻融3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本 放于-20C或-80C保存，但应避免反复冻融注：以上标本置4C保存应小于1周，-20C或-80C均应密封保存，-20C不应超过1个月，-80C 不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测操作步骤实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37C溶解）；试剂或样品稀释时， 均需混匀，混匀时尽量避免起泡实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行 稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔空白孔加样品稀释液100』，余孔分别加标 准品或待测样品100』，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔 壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37C反应120分钟为保证实验结果有效性， 每次实验请使用新的标准品溶液2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。

每孔加检测溶液A工作液100』（在使用前一小时内配制）， 酶标板加上覆膜,37C反应60分钟3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400叫每孔， 甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）4. 每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100叫 酶标板加上覆膜37C反应60分钟5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350叫每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）6. 依序每孔加底物溶液90pl，酶标板加上覆膜37C避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标 准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）7. 依序每孔加终止溶液50』，终止反应，此时蓝色立转黄色终止液的加入顺序应尽量与底 物液的加入顺序相同为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）在加终止液后立即进行检测注：1. 试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染2. 加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本/标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一 个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值 的准确性及重复性。

一次加样时间（包括标准品及所有样品）最好控制在10分钟内，如标 本数量多，推荐使用多道移液器加样3. 孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜， 以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态同 时应严格遵守给定的孵育时间和温度4. 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔 中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数5. 试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或 瓶盖的液体沉积到管底标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量 配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆请精确配置标准品及工作液，尽量不要 微量配置（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10以1，以避免由于不准确稀释而造成的 浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液6. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟），如颜 色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

7. 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数洗板方法1. 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水 纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟， 根据需要，重复此过程数次2. 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中特异性本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠皮质醇（Cortisol），且与其它相关蛋白无交叉反应计算以标准物的浓度为纵坐标（对数坐标），OD值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘 出标准曲线推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3,根据样品的OD值由 标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回 归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际 浓度检测范围：2.82 ng/ml - 180 ng/ml最低检测限：1.41 ng/mL说明1. 只有全部使用试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产 品。

只有严格遵守试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果2. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂 避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果3. 试剂盒保存：请收到试剂盒后尽快将标准品、检测溶液A和检测溶液B保存于-20°C，其余试 剂短期保存请置于4°C，长期保存则置于-20Co4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶5. 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响6. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置7. 有效期：6个月8. 本操作说明适用于48T试剂盒，但48T试剂盒所有试剂减半。