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神经生长因子及其受体对前列腺癌细胞生物学特性的影响及其机制神经生长因子及其受体对前列腺癌细胞生物学特性的影响及其机制专业：人体解剖学与组织胚胎学博士研究生：陈昌杰导师：何蕴韶教授中山大学基础医学院人体解剖学教研室摘要目前，前列腺癌发病率在全球范围内呈上升趋势，在欧美等国家居男性恶性肿瘤第二位我国前列腺癌发病率虽低于欧美等国家，但随着我国人口老龄化和饮食结构的改变，近年来发病率日趋增高前列腺癌病因复杂，而且与多因素有关，研究表明N G F 及其受体与前列腺癌的发生、发展、预后等相关N G F 具有促进神经元生长、发育、再生的功能，除了对神经细胞作用以外，N G F 对非神经细胞也起着重要的作用N G F 以旁分泌或自分泌模式调节神经系统和非神经系统起源的肿瘤细胞生长，如N G F 具有刺激前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞增殖的能力，以及N G F 能增强胰腺癌细胞对周围组织的侵润性N G F 与两个不同的细胞表面受体—T ^ 渔( 酪氨酸激酶受体A ) 、p 7 5 受体( 神经营养因子低亲和力受体) 结合而发挥其生物学作用p 7 5 为神经营养因子低亲和力受体，分子量为7 5 k D ，简写为p 7 5 或p 7 5 N 1 8 ，该基因在1 9 8 6 年首次被克隆。

人类p 7 5 基因定位于1 7 q 2 1 有意思的是与前列腺癌相关的肿瘤抑制基因也位于1 7 q 1 2 ．1 7 q 2 2 ，前列腺癌转移抑制基因也同样位于1 7号染色体而定位于1 7 q 的N M 2 3 肿瘤转移抑制基因已经被排除作为前列腺癌转移抑制基因的可能性p 7 5 基因位于1 7 q 2 1 ，在前列腺癌相关的肿瘤抑制基因和肿瘤转移抑制基因附近，因此该基因的功能可能对前列腺癌发生、发展起作用研究表明p 7 5 能够诱导不同类型细胞( 包括T S U ．P r l 、P C ．3 等前列腺癌细胞株) 的神经生长因子及其受体对前列腺癌细胞生物学特性的影响及其机制凋亡，具有抑制N G F 刺激T S U —P r l 、P C ．3 前列腺癌细胞株增殖的能力研究还发现，与正常前列腺上皮细胞中的表达情况不同，在前列腺癌细胞形成的过程中，p 7 5 逐渐失去其表达，在四种转移性前列癌细胞株中p 7 5 完全不表达文献报道，在正常上皮细胞中p 7 5 受体的表达率为1 0 0 ％，但在癌形成过程中，特别是在分化良好的肿瘤中其表达减少到3 7 ％，分化中等的下降到3 6 ％，分化较差的仅仅为1 6 ％。

p 7 5 基因表达与前列腺肿瘤病理学分级呈负相关，p 7 5 受体和血清P A S 水平可以作为前列腺癌的辅助诊断工具有研究表明，在前列腺癌细胞株( P C ．3 ) 中表达p 7 5受体，可导致细胞凋亡增加，抑制微卫星癌的形成，更深入地研究证实，对前列腺癌而言，p 7 5 是一种新的肿瘤转移抑制基因p 7 5 与T r k A 受体协同性的提高N G F对T r k A 受体反应性，p 7 5 又与} i i j - N 腺细胞凋亡有关，因此，p 7 5 受体失表达可被视为前列腺肿瘤细胞阻止凋亡机制的～个环节p 7 5 对膀胱肿瘤生长的抑制作用，可能是通过下述机制来实现，既诱导肿瘤细胞停留在G 1 期，同时减少S 期细胞数量，阻碍细胞周期进展最新文献报道，p 7 5 通过N f k a p p a B 和J u n K 信号途径抑制P C ．3 细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡T r k 受体为酪氨酸激酶受体家族，其细胞外区域与原肌球蛋白融合，具有激活酪氨酸激酶的活性该家族包括T r k A 、T r k B 、T r k C 三种受体，通过与不同的神经营养因子结合，来调节中枢和周围神经元的生长、分化、凋亡。

T r k 基因最初作为癌基因，该基因编码的T r k A ，分子量为1 4 0 k D ，能以高亲和力与N G F 结合T r k A 在神经发育、调节细胞分化和细胞死亡中起着关键作用，而N G F ／T r k A 信号传导途径如何? 及其对肿瘤发生、发展的作用如何? 均未完全清楚前列腺癌细胞株完全失去p 7 5 受体表达，但保留T r k A 的表达利用吲唑复合物C E P ．7 5 l ( 酪氨酸激酶受体抑制剂) 抑制N G F ／T r k A 信号传导途径，能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导前列腺肿瘤细胞凋亡，说明N G F ／T r k A 信号通路在前列腺癌中起着非常重要的作用目前关于N G F 及其受体在前列腺癌中的表达情况及其与临床病理的关系，以及p 7 5 和T r k A 对前列腺癌细胞的作用等问题，仍有待深入地研究若针对上述问题的研究得以实现，那么，基于研究的进一步设想是，能否采用p 7 5 转基因治疗前列腺癌，能否采用阻断N G F ／T r k A 信号传导途径的方式，来抑制前列腺肿瘤细胞的增殖，以实现阻止肿瘤细胞生长的目的神经生长因子及其受体澍前列腺癌细胞生物学特性的影响及其机制本研究采用免疫组织化学的方法研究p 7 5 表达与前列腺癌临床病理的相关性；采用基因工程技术在前列腺癌细胞株表达p 7 5 ，探讨p 7 5 受体对前列腺癌细胞生物学特性的影响及其分子机制；采用干扰R N A 技术抑制前列腺癌细胞株中Y r k A 受体表达，探讨其对前列腺癌细胞生物学特性的影响，为研究N G F 及其受体在前列腺癌的发生、发展及作用的分子机制提供实验基础，并探讨一条新的、合理、有效的前列腺癌基因治疗方法。

第1 章神经生长因子及其受体在前列腺癌中的表达及意义目的：探讨神经生长因子( N e r v eg r o w t hf a c t o r , N G F ) 及其受体T r k A 、p 7 5 在前列腺良性增生和前列腺癌中的表达及意义方法：采用免疫组织化学S A B C 法检测前列腺良性增生组织( 1 0 例) 、前列腺腺癌组织( 高分化8 例、中分化1 4 例和低分化2 3 例) 中N G F 和T r k A 、p 7 5 的表达采用卡方检验中费歇尔精确概率法进行统计学分析结果：N G F 和Y r k A 在前列腺良性增生组、前列腺癌高分化组、中分化组、低分化组中均有表达p 7 5 在前列腺良性增生组( 1 0 ／1 0 ，1 0 0 ％) 、高分化组( 4 ／8 ，5 0 ％) 、中分化组( 6 ／1 4 ，4 2 ％) 、低分化组( 3 ，2 3 ，1 3 ％) 中的表达率呈逐渐降低趋势，前列腺良性增生组与前列腺癌高分化组、中分化组、低分化组相比均有显著性差异( P 1 ．9 ，表明m I 乇N A 完整性和纯度良好( 见图2 ．1 ) 2 ．2p 7 5 全长基因的获取以胶质细胞瘤中的总R N A 为模板，用R T - P C R 扩增片段，1 ％琼脂糖凝胶电泳显示，扩增片段为1 3 8 0 b p 与预计的大小相符，与实验预期结果相吻合( 见图2 ．2 ) 。

2 ．3p 7 5 ．T ／A 克隆构建及鉴定使用B a m H I 和E c o R ／进行双酶切签定，切出的片段为1 3 8 0b p ，酶切鉴定结果与预计结果一致酶切鉴定的正确质粒命名为p 7 5 一T ／A( 见图2 ．3 ) 2 ．4 真核表达载体构建经B a m H I 和E c o R j 双酶切鉴定，切出的片段大小与预计的大小一致，鉴定正确的重组载体命名为p c D N A 3 ．1 ( + ) - p 7 5 ，质粒切下5 ．4 k b 和1 3 8 0 b p的两条带( 见图2 - 4 ) 测序鉴定所得结果与g e n b a n k 一致( 见图2 - 5 A 、B 、C ) 2 ．5p 7 5 细胞转染后，经G 4 1 8 筛选后3 周以后开始形成的细胞的单克隆( 见图2 —6 ) 2 ．6p 7 5 基因在细胞中转录产物的检测将转染后的细胞提取总R N A 进行R T - P C R反应，设空质粒组为对照，经电泳可见，转染p c D N A 3 ．1 ( + ) 一p 7 5 的P c 一3 细胞扩增出目的片段，而转染p c D N A 3 ．1 f + ) 空载体的细胞未见扩增( 见图2 ．7 ) 。

2 ．7 免疫组织化学将重组质粒转染P C ．3 细胞后，经免疫组化方法检测，发现在转染p c D N A 3 ．1 ( + ) - p 7 5 的P C - 3 细胞胞浆中，充满棕色颗粒，转染p c D N A 3 ．1 ( + ) 空载体的细胞胞浆中无棕色颗粒，表明p c D N A 3 ．1 ( + ) 一p 7 5 重组质粒在P C 一3 细胞中表达了p 7 5 ( 见图2 - 8 A ，2 ．8 B ) 2 ．8 免疫荧光细胞化学检测将重组质粒转染P C ．3 细胞后，经免疫荧光细胞化学方法检测，发现在转染p c D N A 3 ．I ( + ) 一p 7 5 的P c 一3 细胞胞浆中，有绿色荧光，转染3 0 一神经生长因子及其受体对前列腺癌细胞生物学特性的影响及其机制p c D N A 3 ．1 ( + ) 空载体的细胞胞浆中无绿色荧光，表明p c D N A 3 ．1 ( + ) ·p 7 5 重组质粒在P C ．3 细胞中表达了p 7 5 ( 见图2 - 9 A ，2 ．9 B ) 2 ．9 流式细胞检测结果采用流式细胞仪分析p 7 5 在细胞膜表面的表达，转染p c D N A 3 ．1 ( 十) 一p 7 5 的P C 一3 细胞膜表面的阳性表达率为8 4 ％，而转染p c D N A 3 ．1 ( 十)空载体的细胞无表达( 见图2 ．1 0 ) 。

3 ．1 0W e s t e r nb l o t 表达的蛋白能够被鼠抗人的p 7 5 单克隆抗体所识别( 见图2 一1 1 ) 3 讨论自E r n s t ( 1 9 4 8 ) 和L e v iM o n t a l c i n i ( 1 9 5 1 ) 等发现神经生长因子以来，科学家们对其进行了大量的研究，现已明确N G F 不但可以诱导神经纤维生长，而且可以影响肿瘤细胞的增生、分化及凋亡尽管丌始p 7 5 研究主要在神经系统，但其在血管系统、免疫系统、肿瘤中起很重要的作用，在不同细胞类型作用不同研究结果表明人前列腺组织的恶性进展与其上皮细胞p 7 5 表达呈负相关，认为p 7 5 通过诱导细胞凋亡对前列腺上皮细胞的生长进行负调控，p 7 5 表达缺失消除了生长抑制途径，因此促进了前列腺癌的恶性进展转染p 7 5 基因到前列腺癌L N e a P 细胞，撤除N G F 后引起细胞凋亡【7 6 1 转染p 7 5 基因到P C ．3 细胞后，抑制肿瘤卫星癌的形成，推测p 7 5 可能通过调节增生和凋亡之间的平衡来影响肿瘤的生长，但详细分子机制有待于进一步研究㈣p 7 5 主要在神经系统表达，本实验按照文献‘7 7 1 报道的基因序列设计引物，从外科切除的脑胶质细胞瘤标本中，通过R T - P C R 获得编码基因，运用T 载体克隆技术克隆了p 7 5 全长基因，测序结果与其报道一致。

T 载体克隆技术现已广泛用于P C R 产物克隆和测序其原理是利用T a q 酶能够在P C R 产物的3 ‘端加上一个非模板依赖的A ，而T 克隆载体是一种带有3 ’T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地将P C R 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点中由于该基因较长，所以设计多条引物进行序列测定，与g e n e b a n k 中序列比对证实所获 ● 得的基因序列完全正确，为进一步实验奠定基础本实验构建的重组质粒p c D N A 3 ．1 ( + ) 一P 7 5 质粒具有如下特点( 1 ) 重组质粒携带有人p 7 5 的丌放阅读框架 2 ) p 7 5 基因5 ’端上游为真核表达的巨细胞病毒强启动子，作为基因高水平转录顺式调控元件不同的真核。