乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化【医学论文】.doc

医学论文-乙型肝炎病毒截短 C 基因与前 S1 基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化作者：胡兴斌，尹文，韦三华，雷迎峰，吕欣，孙梦宁，杨敬，徐志凯 【关键词】 ,乙型肝炎病毒Expression and purification of truncated C gene combined with preS1 gene from HBV in E.coli【Abstract】 AIM: To construct the prokaryotic recombinant plasmid to express HBV truncated C gene with preS1 gene and to acquire and purify the fused protein for antigenic analysis. METHODS: The target gene was amplified by PCR and digested by restrictive enzyme before cloned into pET28a. It was then transformed into E.coli DH5α and the positive recombinant plasmid named pET28aCtpreS1 was sequenced. The target protein was distinctly expressed after transformed into E.coli BL21 and induced with IPTG. The protein was scanned and purified on Ni2+NTA column and Western blot was performed after solubility analysis. RESULTS: The recombinant plasmid pET28aCtpreS1 was successfully constructed and could efficiently express the target gene. Protein production mainly was in inclusion body but could be purified through Ni2+NTA column. The purified protein maintained the antigen activity. CONCLUSION: The truncated HBcAg combined with preS1 antigen can efficiently be expressed and purified, which lays a foundation for further research of novel vaccine against HBV.【Keywords】 hepatitis B virus; fused protein; prokaryotic expression; vaccine【摘要】 目的: 构建乙型肝炎病毒(HBV)截短 C 基因和前 S1 基因重组原核表达质粒，获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析. 方法: PCR 扩增获得截短C 基因片段和前 S1 基因，双酶切后克隆至原核表达质粒 pET28a，转化 E.coli DH5α，酶切鉴定得阳性重组质粒 pET28a 并测序；然后转化 E.coli BL21，IPTG 诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白组成；可溶性分析后用Ni2+NTA 凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白，Western Blot 分析特异性和抗原性. 结果: 成功构建了 HBV 截短 C 基因和前 S1 基因融合的原核表达质粒 pET28aCtpreS1，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，Ni2+NTA 纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性. 结论: HBV 截短 HBcAg 和 preS1 抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化，为研究新型乙肝疫苗奠定了基础.【关键词】 乙型肝炎病毒；融合蛋白；原核表达；疫苗0 引言乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)导致的病毒性肝炎目前尚无十分有效的治疗措施，疫苗接种是控制和预防乙型肝炎的重要手段，但部分人群对现有的疫苗不应答或低应答而导致接种失败，因此需要研发新型 HBV 疫苗. 我们利用基因重组技术构建含截短 C 基因和 preS1 基因联合的原核表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化，初步分析其免疫性和特异性，为比较不同来源的 HBV 候选疫苗分子和深入研究 HBV 新型疫苗奠定基础.1 材料和方法1.1 材料E.coli DH5α 和 BL21 菌株由本实验室保存;pET28a 质粒由范雄林博士惠赠; 带 HBV 截短 C 基因和 preS1 基因的质粒 pDE22CtpreS1w 由本实验室构建; Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶(TaKaRa 公司);胶回收试剂盒(上海华舜公司);T4 DNA 连接酶(上海生物工程公司);Ni2+NTA 凝胶亲和层析柱(Qiagen 公司);HRP 标记羊人 IgG，DNA 分子标准和低分子蛋白质标准(华美生物工程公司).1.2 方法1.2.1PCR 引物设计与合成根据 GenBank 中的 HBV C 基因和前 S1 基因序列，利用生物学信息软件设计其扩增引物,以扩增 C 基因编码蛋白 N 端 155 个氨基酸的基因片段和前 S1 全基因. 上游引物P1：5′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′,含 EcoRⅠ酶切位点；下游引物P2：5′GCGAAGCTTTTAACCCAGCCCGAATGCTCC3′，含 HindⅢ酶切位点和终止码TTA. 交上海生物工程公司合成.1.2.2 目的基因的扩增以 pDE22CtpreS1w 质粒为模板进行 PCR 扩增，反应体系为：质粒（1∶100 稀释）5 μL，10×Buffer 5 μL ，10 mmol/L dNTPs 4 μL，P1（100 pmol/L）2 μL，P2（100 pmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶 2 μL，用超纯水补至终体积 50 μL. 反应条件：预变性 94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min,共进行 30 个循环，最后在 72℃延伸 10 min. 取 5 μL 反应产物进行琼脂糖电泳分析.1.2.3pET28aCtpreS1 重组质粒的构建及鉴定连接、转化、重组质粒鉴定均参照文献［1］进行，将酶切鉴定正确的重组质粒交由北京三博远志公司测序.1.2.4 蛋白表达和可溶性分析自 DH5α 中提取阳性重组质粒，转化大肠杆菌 BL21，挑取单菌落（同时设空载体质粒转化的大肠杆菌 BL21 为对照），置 5 mL LB 培养液中（含卡那霉素 50 g／L），37℃振摇过夜，次日 1∶100 的稀释度加入 5 mL LB 培养液中 37℃振摇 3 h 后，测定 A600 nm 约 0.4～0.6 时加入IPTG 至终浓度 1 mmol/L，37℃继续振摇 4～5 h，离心收菌. 用 PBS(pH 8.0)悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度 0.1 g/L，4℃放置 20 min，超声破碎，4℃下 10 000 g 离心 10 min，收集上清和沉淀. 将菌体沉淀、裂解上清、裂解沉淀和空质粒转化菌分别加入等体积的 2×样品缓冲液，沸水中加热 5 min，12 000 g 离心 5 min，取上清，每孔 15 μL 进行 SDSPAGE 电泳，电泳在恒压下进行（浓缩胶中为 100 V，分离胶中为 120 V）. 电泳结束后，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中染色 2 h，然后用脱色液脱色至背景清晰. 薄层扫描分析目的蛋白表达带占菌体蛋白百分比.　　1.2.5 亲和层析法纯化表达蛋白参照 Qiagen 公司镍离子亲和层析柱(Ni2+NTA)操作说明进行. 首先离心收集 1 L 诱导宿主菌，冰浴 15 min；按 5 L/kg 湿菌的比例加入含 8 mol/L 尿素 的 Buffer B（pH 8.0），室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4℃下 10 000 g 离心收集上清，弃去沉淀；将 1 mL Ni2+NTA 树脂悬浮液与一定量清亮裂解上清于室温轻柔摇动混匀(100 r/min 摇动 15～60 min) 后，将其混合液装柱；依次用 Buffer C（pH 6.3）, Buffer D（pH 5.9）, Buffer E（pH 4.5）洗脱，分别收集洗脱液. 取各部分样品进行SDSPAGE 分析.1.2.6Western Blot 检测表达蛋白将纯化蛋白进行 SDSPAGE 凝胶电泳，然后将蛋白质进行电转移至 NC 膜上（滤膜孔径 0.22 μm，转移条件为恒流 100 V，1 h）. 用乙型肝炎阳性患者抗 HbcAg，抗 preS1 阳性血清（来自西京医院检验科）作为一抗，HRP 标记羊抗人的 IgG 作为二抗，DAB（0.6 g／L）显色，至目的条带染色清晰时终止反应.2 结果2.1 重组表达质粒的鉴定阳性重组质粒酶切产物预期大小（约 630 bp）处出现条带（图 1）. 序列测定结果与文献报道一致.2.2 融合蛋白的表达与溶解形式分析经 SDSPAGE 电泳检测，在 Mr 约 24 000处有一明显的条带，与预期的融合蛋白大小一致. 该融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，上清液中几乎无诱导表达的融合蛋白. 薄层扫描显示其占菌体蛋白的 40%（图 2）.2.3 融合蛋白的大量表达及纯化目的蛋白在 Buffer D（pH 5.9），Buffer E（pH 4.5）洗脱液中，扫描显示纯度在 90%以上（图 3）.2.4 表达蛋白的 Western blot 预期大小处可见条带染色清晰,纯化的蛋白很好地保持了与 HBV 阳性患者血清的结合活性（图 4）.3 讨论　　疫苗是预防 HBV 感染的重要手段，但相当数量的接种者对现临床使用的疫苗无应答或低应答，而为数众多的感染者需要有效的治疗，所以迫切需要新型HBV 疫苗.抗原特异性 CTL 所介导的细胞毒作用在病毒感染的控制和痊愈过程中起核心作用［2-3］. 多个 CTL 表位的疫苗研究策略是近年各类 HBV 新型疫苗研究的热点. HBV 核心 C 基因在不同亚型间最为保守, 在它编码的 180 多个氨基酸中，CTL 表位多位于第 150 位氨基酸（amino acid, AA）以前，其中 18～27 位 AA为 HLAA0201 所限制，第 88～96 位 AA 被 HLAA11 所限制，第 141～150 位 AA 为HLAAw68 和 HLAA31 分子所限制，此外第 75～81 位 AA 或 72～88 位 AA 是很强的构像型 B 细胞表位，因此核心抗原是比较理想的疫苗研究靶分子［4-5］. 在既往 HBV 疫苗研究中人们大多选用 S 基因编码的蛋白，并辅以 CpG, IL2 等分子佐剂试图达到免疫目的，但效果并不理想［6-7］. 而 preS1 基因编码蛋白含有HBV 和肝细胞膜结合的位点，并且相当保守, 肝细胞、B 细胞和 T 细胞均可表达针对其第 21～47 位 AA 的受体，故前 S1 抗体是除表面抗体外又一重要的中和抗体［8］. 因此 HBV 的 C 基因和 preS1 基因已经成为近年来 HBV 新型疫苗研究的重点［9］.几乎所有新型 HBV 疫苗如亚单位疫苗、DNA 疫苗、分枝肽合成疫苗、新载体疫苗或植物转基因疫苗的前期研究工作中都需要候选分子高效表达,以便在体外评价疫苗候选分子刺激细胞增殖的潜力和 CTL 杀伤效应,达到全面评价候选分子的目的［10-12］. 而 HBV 各个基因片。