紫山药薯蓣皂苷元酶法提取优化及抗氧化性.docx

紫山药薯蓣皂苷元酶法提取优化及抗氧化性摘要：以紫山药为试验材料, 对比分析了纤维素酶和果胶酶对紫山 药薯蓣皂苷元的提取效果, 并在单因素试验结果基础上采用正交试验对 纤维素酶提取紫山药薯蓣皂苷元的工艺进行优化结果表明, 最佳提取 工艺为加酶量2.0%、料液比1 : 20 g/mL、提取时间50 min、酶解温 度45弋此条件下紫山药薯蓣皂苷元的平均提取率为 0.164%±0.089%体外抗氧化试验中, 紫山药薯蓣皂苷元表现出一定 的抗氧化能力，对DPPH自由基(DPPH・)和羟基自由基(•OH)的清除 能力均弱于维生素C关键词：紫山药;薯蓣皂苷元; 酶法辅提;抗氧化薯蓣皂苷元(Diosgenin )俗称皂素，是一种重要的天然甾体皂 苷元，属螺甾烷醇糖苷元，是薯蓣皂苷的水解产物，以糖苷的形式广 泛存在于薯蓣科和豆科植物中，如葫芦巴的种子、盾叶薯蓣、穿龙薯 蓣、黄山药和紫黄姜等植物的块茎［1］薯蓣皂苷元是合成黄体酮、可 的松、强的松、双烯醇酮醋酸酯、性激素和催产素等甾体激素的重要 原料［2］现代研究表明，薯蓣皂苷元具有脱敏、抗炎、降脂、抗氧化 抗肿瘤、保肝以及抗病毒等作用，具有很高的保健价值［1,3-5］。

紫山药( Dioscorea alata )又名紫莳药、参薯等，是薯蓣科 (Dioscoreae )山药属(Dioscorea L.)的干燥根茎，含有丰富的多 糖、花青素、薯蓣皂苷元和尿囊素等多种活性成分刘影等 ［6］测定浙 江紫山药中薯蓣皂苷元的含量为 2.14%，高于张玲［7］报道的黄山药中 薯蓣皂苷元含量，可见紫山药是薯蓣皂苷元提取的优质原料酶辅助 提取方法是近年来用于植物功能性成分提取的一项生物工程技术，而 国内外将酶工程技术用于紫山药薯蓣皂苷元提取的研究仍鲜见报道 试验比较研究纤维素酶和果胶酶对紫山药薯蓣皂苷元的提取效果，并 采用正交试验对复合酶法提取紫山药薯蓣皂苷元的提取工艺进行优化， 为紫山药的综合开发利用和提高附加值提供科学依据1.1试验材料紫山药为河南温县产紫山药新鲜紫山药清洗、去皮后，切成1〜 3 mm厚度的薄片，置于60 °C恒温箱烘24 h，称恒重、粉碎，过60 目筛后，在二氧化硅干燥器内常温保存备用纤维素酶(10 000 U/g) ，索莱宝公司；果胶酶(10 000 U/g)， 索莱宝公司；薯蓣皂苷元标准品，中国药品生物制品检定所；香草醛、 冰醋酸、高氯酸、无水乙醇、醋酸钠等均为分析纯，国药集团。

BS224S分析天平：德国赛多利斯公司；UV power紫外可见光分 光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；HH-2数显恒温水浴锅： 上海乔跃电子科技有限公司；202-3AB电热恒温鼓风干燥箱：上海乔 跃电子科技有限公司； PHS-3C 精密 pH 计：上海雷磁仪器厂； RE2000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；D5-R2离心机：湖南湘 仪离心机仪器有限公司1.2试验方法1.2.1薯蓣皂苷元标准曲线的绘制准确称取干燥至恒重的薯蓣皂苷元标准品5.0 mg，用石油醚溶解， 定容至50 mL，摇匀得0.1 mg/mL的薯蓣皂苷元标准溶液分别移取 0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 的 0.1 mg/mL 薯蓣皂苷元标准溶 液置于具塞试管中，置沸水浴中加热使其溶剂挥干再分别加入5 mL 高氯酸，混匀封塞，置25 C水浴中显色25 min，取出冷却至室温 以高氯酸为空白对照，用紫外分光光度计在 410 nm 处测定其吸光度 以薯蓣皂苷元质量浓度(mg/mL )为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标 准曲线如图 1 所示，其线性回归方程为： y=9.897 1x-0.006 4， R2=0.999 3。

5 _ J- 1 z L (>-(||.'[)1 ■[Kft.图1薯蓣皂苷元标准曲线1.2.2紫山药粉预处理准确称取紫山药粉20 g置索氏抽提器中，用乙醚90 °C回流脱脂， 脱脂后的紫山药粉中乙醚挥发完后，加入85%乙醇90 C回流提取， 以去除可溶性糖；将挥发完乙醇后紫山药粉60 C恒温箱干燥，恒重， 得紫山药皮预处理粉1.2.3薯蓣皂苷元的提取工艺流程预处理紫山药粉与水混合-加醋酸钠-醋酸缓冲液调节pH-加入 一定量的酶在一定温度下酶解f离心(4 000 r/min , 15 min )弃上清 液取滤渣-用1.0 mol/L硫酸在90 C恒温水浴中水解4 h-用12 mol/L NaOH 溶液中和至 pH 为 7.0—离心(4 000 r/min , 15 min ) 弃上清液取滤渣-用蒸馏水将滤渣洗涤3次-滤渣于80 C下充分干燥 —用石油醚回流提取6 h—离心(4 800 r/ min, 15 mi n)取上清液— 低温减压回收溶剂-得粗薯蓣皂苷元粉末1 . 2 .4薯蓣皂苷元含量测定将1.2.3步骤所得粗薯蓣皂苷元粉末在60 C下干燥至恒重，精确 称取粗薯蓣皂苷元粉末50 mg，用甲醇定容至100 mL做薯蓣皂苷元 储备液。

取储备液1 mL于具塞试管中，置70 C水浴使其溶剂挥干 然后按照1.2.1方法处理，测定其吸光度曙術E彷兀淀収季豁洼酉『兀皿穴(£ )繩L喚粉底吐 x urn ( I I1.2.5紫山药薯蓣皂苷元提取的单因素试验1.2.5.1加酶量对薯蓣皂苷元提取率的影响2 种酶的加酶量(紫山药皮粉干重酶量)分别为 0.5%，1%， 1.5% , 2.0% , 2.5%和 3.0%，在料液比 1： 20(g/mL ), pH 5.0 , 温度40 C条件下酶解40 min，按1.2.4的方法处理并测定410 nm处 吸光度，并计算薯蓣皂苷元提取率1.2.5.2酶解时间对薯蓣皂苷元提取率的影响酶解时间分别为30,40,50,60, 70和80 min，在加酶量 1.5%，料液比1：20( g/mL ), pH 5.0，温度40 C的条件下酶解， 按124的方法处理并测定410 nm处吸光度，并计算薯蓣皂苷元提取 率1.2.5.3酶解温度对薯蓣皂苷元提取率的影酶解温度分别为 25 °C,30 °C,35 °C,40 °C,45°C,50 °C和 55 C,在加酶量1.5%，料液比1：20(g/ mL),pH 5.0的条件下 酶解40 min，按1.2.4的方法处理并测定410 nm处吸光度，并计算 薯蓣皂苷元提取率。

1.2.5.4料液比对薯蓣皂苷元提取率的影响料液比分别为 1：5，1：10，1：15，1：20 和 1：25(g/mL)， 在pH 5.0，加酶量1.5%，温度40 C条件下酶解40 min，按1.2.4的 方法处理并测定410 nm处吸光度，并计算薯蓣皂苷元提取率1.2.5.5 pH对薯蓣皂苷元提取率的影响pH 分别为 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 和 6.0，在加酶量1.5%，料 液比1：20( g/mL )，温度40 C条件下提取40 min，按1.2.4的方 法处理并测定410 nm处吸光度，按1.2.4的方法处理并并计算薯蓣皂 苷元提取率1.2.6纤维素酶对紫山药薯蓣皂苷元提取的正交试验在单因素试验基础上，设计出4因素3水平L9(34)的正交试验， 见表1按照1.2.2的方法提取紫山药薯蓣皂苷元，并计算薯蓣皂苷元 提取率，以确定纤维素酶法提取紫山药薯蓣皂苷元的最佳工艺条件表1正交试验因素水平护平飞加酣.―b斛藏比/ _匚臨挪 —帥 店 mL '] rrin w1 10 1:10 40 35D 酶解温度/ W 11.01:104035 21.51:155040 32.01:206045 水平因素A加酶量/ % B料液比/ ©mL-1) C酶解时间/ min1.3紫山药薯蓣皂苷元体外抗氧化活性的测定 按照正交试验获得的最佳工艺条件得紫山药薯蓣皂苷元提取液后， 按照1.2.3的方法制备粗薯蓣皂苷元粉末，按照1.2.4的方法测定洗脱 液吸光度，并计算紫山药皮薯蓣皂苷元质量浓度，按照不同要求，配置不同浓度的薯蓣皂苷元甲醇溶液，参照文献 [9]的方法分别进行DPPH•清除率的测定、・OH清除率的测定、体外抗氧化试验。

2 结果与分析2.1紫山药薯蓣皂苷元提取的单因素试验2.1.1加酶量对薯蓣皂苷元提取率的影响由图2可知，在加酶量为0.5%〜1.5%范围内，紫山药薯蓣皂苷元 提取率随着加酶量的增加而升高，这可能由于在紫山药细胞壁纤维素 酶解不完全时，加酶量增加，酶解程度逐渐增高，薯蓣皂苷元提取率 随之增高当加酶量到一定量后，薯蓣皂苷元提取率趋于稳定，表明 紫山药细胞壁酶解完全提取率最高时纤维素酶加酶量比果胶酶少， 且纤维素酶的提取率比果胶酶高图2加酶量对薯蓣皂苷元提取率的影响2.1.2酶解时间对薯蓣皂苷元提取率的影响由图3可知，酶解时间低于50 min时，紫山药薯蓣皂苷元提取率 随着酶解时间延长逐渐增大，而60〜90 mi n范围时趋向平稳故选择 酶解时间在40〜60 min进一步优化试验图3酶解时间对薯蓣皂苷元提取率的影响2.1.3酶解温度对紫山药薯蓣皂苷元提取率的影响图4酶解温度对薯蓣皂苷元提取率的影响由图 4 可知，在一定的酶解温度范围内，薯蓣皂苷元提取率随着 酶解温度的升高而而逐渐增加，纤维素酶和果胶酶的活性分别在40弋， 50 °C达到最高值，温度继续升高，酶的活性降低，薯蓣皂苷元提取率 也随之降低。

故选择酶解温度在35 C〜45 C进一步优化2.1.4料液比对薯蓣皂苷元提取率的影响由图 5 可知，相同条件下，紫山药薯蓣皂苷元提取率随着料液比 的减小而升高当料液比由1：5(g/ mL)增加到1:15(g/mL )时， 薯蓣皂苷元提取率不断升高，当料液比大于1：15( g/mL )时，薯蓣 皂苷元提取率呈下降趋势一定范围内，提取剂剂量越大，薯蓣皂苷 元浸出率越高；但当提取剂过多时可能由于酶浓度下降，薯蓣皂苷元 提取率反而下降［8］故选择料液比为1：10〜1：20(g/mL)进一步 优化试验图5料液比对薯蓣皂苷元提取率的影响2.1.5 pH对薯蓣皂苷元提取率的影响由图 3 可知，纤维素酶和果胶酶对紫山药薯蓣皂苷元提取率分别 在pH为4.5和5.0时达到最大值，说明不同酶最适宜的pH略有不同 纤维素酶的薯蓣皂苷元提取率最高值高于果胶酶纤维素酶最适宜pH 确定为4.5图6 pH对薯蓣皂苷元提取率的影响2.2紫山药薯蓣皂苷元提取的正交试验紫山药薯蓣皂苷元提取的正交试验结果(表2)分析表明，根据极 差结果得出各因素对紫山药薯蓣皂苷元提取效果重要性的顺序为RD> RA>RC>RB,即酶解温度〉加酶量〉酶解时间〉料液比。

最佳提取 工艺为A3B3C2D2，即加酶量2.0%，料液比1：20(g/mL )，提取 时间50 min，酶解温度45 °C对最佳提取工艺条件做验证试验，重 复3次，此条件下紫山药薯蓣皂苷元的平均提取率为0.164%±0.089% ， 高于正交试验中所有试验结果表2紫山药薯蓣皂苷元提取的正交试验结果毂開15B15脯悄的 CLIalGOJQa.-loD.-l3 3 S 1 0,154賂 0,149 0J51 0.1^9 A5B,CjDjA± 0.153 &J52 0J54 0.158试验编号ABCD薯蓣皂苷元提取率/% 111110.142 212220.156 313330.15 421230.152 522310.15 623120.158 731320.16832130.149 933210.154K10.1490.1510.1500.149A3B3C2D2K20.1530.1520.1540.158 K30.1540.1540.1530.150 R0。