药典生物样品定量分析方法验证指导原则.docx

精品名师归纳总结生物样品定量分析方法验证指导原就一、范畴精确测定生物基质〔如全血、血清、血浆、尿〕中的药物 浓度，对于药物和制剂研发特殊重要 这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性， 或依据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性准备 因此， 必需完整的验证和 记录应用的生物分析方法，以获得牢靠的结果本指导原就供应生物分析方法验证的要求， 也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证 本指导原就二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原就的技术要求应当在相应的生物样品分析中遵守 GLP原就或 GCP原就二、生物分析方法验证〔一〕分析方法的完整验证分析方法验证的主要目的是， 证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的牢靠性 此外，方法验证应接受与试验样品相同的抗凝剂 一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证 当难于获得相同的基质时， 可以接受适当基质替代，但要说明理由一个生物分析方法的主要特点包括： 选择性、定量下限、 响应函数和校正范畴〔标准曲线性能〕、精确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液 中储存和处理全过程中的稳固性。

有时可能需要测定多个分析物 这可能涉及两种不同的药物， 也可能涉及一个母体药物及其代谢物， 或一个药物的对映体或异构体 在这些情形下， 验证和分析的原就适用于全部涉及的分析物对比标准物质在方法验证中，含有分析物对比标准物质的溶液将被加入到空白生物基质中此外，色谱方法通常使用适当的内标应当从可追溯的来源获得对比标准物质 应当科学论证对比标准物质的适用性分析证书应当确认对比标准物质的纯度， 并供应储存条件、 失效日期和批号对于内标， 只要能证明其适用性即可， 例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结当在生物分析方法中使用质谱检测时， 举荐尽可能使用稳固同位素标记的内标它们必需具有足够高的同位素纯度， 并且不发生同位素交换反应， 以防止结果的偏差1. 选择性该分析方法应当能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分应当使用至少 6 个受试者的适宜的空白基质来证明选择性 〔动物空白基质可以不同批次混合〕 ，它们被分别分析并评判干扰 当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的 20%，并低于内标响应的 5%时，通常即可以接受。

应当考察药物代谢物、 经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度 在适当情形下， 也应当评判代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性2. 残留应当在方法建立中考察残留并使之最小残留可能不影响精确度和精密度 应通过在注射高浓度样品或校正标样后， 注射空白样品来估量残留 高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的 20%，并且不超过内标的 5%假如残留不行防止，应考虑特殊措施，在方法验证时 检验并在试验样品分析时应用这些措施， 以确保不影响精确度和精密度 这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品3. 定量下限定量下限是能够被牢靠定量的样品中分析物的最低浓度， 具有可接受的精确度和精密度定量下限是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的4. 标准曲线应当在指定的浓度范畴内评判仪器对分析物的响应， 获得标准曲线 通过加入已知浓度的分析物〔和内标〕到空白基质中，制备各浓度的校正标样，其基质应当与目标试验样品基质相同 方法验证中争辩的每种分析物和每一分析批， 都应当有一条标准曲线在进行分析方法验证之前， 最好应当明白预期的浓度范畴 标准曲线范畴应当尽量掩盖预期浓度范畴， 由定量下限和定量上限 〔校正标样的最高浓度〕 来准备。

该范畴应当足够描述分析物的药动学应当使用至少 6 个校正浓度水平， 不包括空白样品 〔不含分析物和内标的处理过的基质样品〕和零浓度样品〔含内标的处理过的基质〕每个校正标样可以 被多次处理和分析应当使用简洁且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式 空白和零浓度样品结果不应参与运算标准曲线参数可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结应当提交标准曲线参数， 测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交 在方法验证中，至少应当评判 3 条标准曲线校正标样回算的浓度一般应当在标示值的± 15%以内，定量下限处应当在±20%内至少 75%校正标样，含最少 6 个有效浓度，应中意上述标准假如某个校正标样结果不符合这些标准， 应当拒绝这一标样， 不含这一标样的标准曲线应被重新评判，包括回来分析最好使用新颖配制的样品建立标准曲线， 但假如有稳固性数据支持， 也可以使用预先配制并储存的校正标样5. 精确度分析方法的精确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度，表示 为：〔测得值 / 真实值〕 xl00%应接受加入已知量分析物的样品来评估精确度，即质控样品质控样品的配制应当与校正标样分开进行， 使用另行配制的储备液。

应当依据标准曲线分析质控样品， 将获得的浓度与标示浓度比照 精确度应报告为标示值的百分比应通过单一分析批〔批内精确度〕和不同分析批〔批间 精确度〕获得质控样品值来评判精确度为评判一个分析批中不同时间的任何趋势， 举荐以质控样品分析批来证明精确度，其样品数不少于一个分析批预期的样品数批内精确度为了验证批内精确度， 应取一个分析批的定量下限及低、 中、高浓度质控样品，每个浓度至少用 5 个样品浓度水平掩盖标准曲线范畴：定量下限，在不高于定量下限浓度 3 倍的低浓度质控样品， 标准曲线范畴中部邻近的中浓度质控样品，以及标准曲线范畴上限约 75%处的高浓度质控样品精确度均值一般应在质控样品标示值的± 15%之内，定量下限精确度应在标示值的土 20%范畴内批间精确度通过至少 3 个分析批，且至少两天进行，每批用定量下 限以及低、中、高浓度质控样品， 每个浓度至少 5 个测定值来评判 精确度均值一般应在质控样品标示值的± 15%范畴内，对于定量下限，应在标示值的± 20%范畴内报告的精确度和精密度的验证数据应当包括全部获得的测定结果， 但是已经记录明显失误的情形除外6. 精密度分析方法的精密度描述分析物重复测定的接近程度， 定义为测量值的相对标准差〔变异系数〕。

应使用与证明精确度 相同分析批样品的结果，获得在同一批内和不同批间定量下限以及低、中、高浓度质控样品的精密度可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结对于验证批内精密度， 至少需要一个分析批的 4 个浓度，即定量下限以及低、中、高浓度，每个浓度至少 5 个样品对于质控样品，批内变异系数一般不得超过 15%，定量下限的变异系数不得超过 20%对于验证批间精密度，至少需要 3 个分析批〔至少 2 天〕 的定量下限以及低、中、高浓度，每个浓度至少 5 个样品对于质控样品，批间变异系数一般不得超过 15%，定量下限的变异系数不得超过 20%7. 稀释牢靠性样品稀释不应影响精确度和精密度 应当通过向基质中加入分析物至高于定量上限浓度，并用空白基质稀释该样品〔每个稀释因子至少 5 个测定值〕，来证明稀释的牢靠性精确度和精密度应在± 15%之内，稀释的牢靠性应当掩盖试验样品所用的稀释倍数可以通过部分方法验证来评判稀释牢靠性 假如能够证明其他基质不影响精密度和精确度，也可以接受其使用8. 基质效应当接受质谱方法时， 应当考察基质效应 使用至少 6 批来自不同供体的空白基质，不应使用合并的基质。

假如基质难以获得，就使用少于 6 批基质，但应当说明理由对于每批基质， 应当通过运算基质存在下的峰面积 〔由空白基质提取后加入分析物和内标测得〕 ，与不含基质的相应峰面积 〔分析物和内标的纯溶液〕 比值， 运算每一分析物和内标的基质因子 进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，运算经内标归一化的基质因子 从 6 批基质运算的内标归一化的基质因子的变异系数不得大于 15%该测定应分别在低浓度和高浓度下进行假如不能适用上述方式， 例如接受样品预处理的情形， 就应当通过分析至少 6 批基质，分别加入高浓度和低浓度 〔定量下限浓度 3 倍以内以及接近定量上限〕，来获得批间响应的变异其验证报告应包括分析物和内标的峰面积，以 及每一样品的运算浓度这些浓度运算值的总体变异系数不得大于 15%除正常基质外， 仍应关注其他样品的基质效应， 例如溶血的或高血脂的血浆样品等9. 稳固性必需在分析方法的每一步骤确保稳固性， 用于检查稳固性的条件， 例如样品基质、抗凝剂、容器材料、储存和分析条件， 都应当与实际试验样品的条件相像用文献报道的数据证明稳固性是不够的接受低和高浓度质控样品 〔空白基质加入分析物至定量下限浓度 3 倍以内以及接近定量上限〕 ，在预处理后以及在所评判的条件储存后马上分析。

由新颖制可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结备的校正标样获得标准曲线， 依据标准曲线分析质控样品， 将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在± 15% 范畴内应通过适当稀释， 考虑到检测器的线性和测定范畴， 检验储备液和工作溶液的稳固性稳固性检查应考察不同储存条件，时间尺度应不小于试验样品储存的时间通常应当进行以下稳固性考察：·分析物和内标的储备液和工作溶液的稳固性·从冰箱储存条件到室温或样品处理温度， 基质中分析物的冷冻和融解稳固性·基质中分析物在冰箱储存的长期稳固性 此外，假如适用，也应当进行以下考察：·处理过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳固性·处理过的样品在自动进样器温度下的稳固性在多个分析物试验中， 特殊是对于生物等效性试验， 应当关注每个分析物在含全部分析物基质中的稳固性应特殊关注受试者采血时，以及在储存前预处理的基质中分析物的稳固性， 以确保由分析方法获得的浓度反映受试者采样时刻的分析物浓度 可能需要依据分析物的结构，按详细情形证明其稳固性〔二〕部分验证在对已被验证的分析方法进行小幅转变情形下， 依据转变的实质内容， 可能需要部分方法验证。

可能的转变包括： 生物分析方法转移到另一个试验室， 转变仪器、校正浓度范畴、 样品体积， 其他基质或物种， 转变抗凝剂、样品处理步骤、储存条件等应报告全部的转变，并对重新验证或部分验证的范畴说明理由〔三〕交叉验证应用不同方法从一项或多项试验获得数据， 或者应用同一方法从不同试验的点获得数据时， 需要相互比较这些数据时， 需要进行分析方法的交叉验证 假如可能，应在试验样品被分析之前进行交叉验证， 同一系列质控样品或试验样品应被两种分析方法测定对于质控样品，不同方法获得的平均精确度应在± 15%范围内，假如放宽，应当说明理由对于试验样品，至少 67%样品测得的两组数值差异应在两者均值的± 20%范畴内三、试验样品分析可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结在分析方法验证后， 可以进行试验样品或受试者样品分析 需要在试验样品分析开头前证明生物分析方法的效能应依据已验证的分析方法处理试验样品以及质控样品和校正标样， 以保证分析批被接受〔一〕分析批一个分析批包括空白样品和零浓度样品，包括至少 6 个浓度水平的校正标样，至少 3 个浓度水平质控样品〔低、中。