简并引物设计方法.docx

自己做过一些简并引物，现将我利用牛物信息学资源设计简并引物的各个步骤作一个总结，各位 战友可将各自的心得体会写下，以便大家交流！！一、 利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA 编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正 保守的首先利用NCBI的Entrez检索系统，杳找到一条相关序列即可随后利用这一序列使用 BLASTp（通过蛋白查蛋白），在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列二、 对所找到的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有ciustal W，也可分析 [url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/其结果入下图所示，所有序列的共有部分将会显示出 来表示保守，“："表示次保守AGGY-RLWLGTFTTAEMAARAHDSAVLALLDR^ AGGY-RLWLGTFTTAEMAARAHDSAVLALLDR-/ IKGS-RLWLGTFTNPEMAARAHDAAVLALSGR-A SRGYSRLWLGTFANPEMAARAHDSAALA1.^GH-I GKRG ARLWLGTYATA EVAAfcA NDAAM LALGGS GKRGARLWLGTYATAEVAARANDAAMLALGGJfi HSK-QR IWLGTFETAEMAARAHDVA ALALRGR# f M # 1 ■+ 井 ¥ 養詈 it 托；子 « ft » # -三、 确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50〜400个aa为宜， 使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条 引物至少18bp左右。

若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以 根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三 次比对总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整最终目的就是有 两个6个aa且两者间距离合适的保守区域四、 利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计（关 于 其 的 使 用 请 见 笔 者 的 另一个 帖 子 ），将参与多序列比对的序列中 的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只 相差以个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W= A / T，H= A/C/T，B= C / G / T，V=A/C/G, D =A/G /T,N=A / C / G/T）,该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的 对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保 证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。

五、 对引物的修饰若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3则其简并度-4x2x4x3x4x3x2=2304，很明显该条引物的简并度多高不利于pcr我们可以通 过用次黄嘌吟代替N （因为次黄嘌吟能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方 法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库我以前发过大家搜索一下把） 最后，这样子设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地 位相同的其他物种。