[生物化学]第十章核酸的分离与纯化.ppt

1,第十章 核酸的分离与纯化,,2,,核酸是分子生物学实验的主要研究对象，许多分子生物学实验的第一步都要进行核酸的提取，如PCR、基因测序及分子克隆等. 提取核酸的种类:真核细胞基因组DNA、质粒DNA、总RNA及mRNA,3,,提取的核酸样品的完整性和纯度直接 关系到最后实验的结果 鉴定技术 : 分光光度技术:样品定量、纯度鉴定 凝胶电泳技术:样品定量、纯度鉴定 分子量测定 、分离核酸片段,,4,第一节核酸分离与纯化的基本过程,一、材料与方法 1.材料：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞 2.方法： 保证核酸一级结构的完整性 原则 排除其他分子的污染，保证样品的纯度,,5,,二、技术路线 1.核酸的释放 破碎细胞，释放核酸 方法：机械法 破坏线性DNA 非机械法 2.核酸的分离与纯化 大分子污染物 污染物 非需要的核酸分子 对后续实验有影响的溶液和试剂,,6,,3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤 浓缩: 沉淀：有机溶剂沉淀法 原理： 洗涤：用70％～75％乙醇去除沉淀中的盐,7,,4、鉴定与保存 1.）核酸的鉴定 浓度、纯度、完整性 ①浓度鉴定 a 紫外分光光度法 260nm 在标准条件下，1个吸光度单位相当于 50g/ml的双链DNA 38g/ml的单链DNA或RNA 33g/ml的单链寡聚核苷酸 b 荧光光度法 荧光染料：溴化乙锭 发出橙红色荧光,8,,②纯度鉴定 a 紫外分光光度法： 测A260／A280的比值判断是否有蛋白质污染 （为什么） A260／A280比值为1.8，纯DNA A260／A280比值为2.0, 纯RNA b 荧光光度法：用溴化乙锭为染料示踪核 酸电泳结果判断纯度,9,,③完整性鉴定：用溴化乙锭为染料示踪核酸电泳结果判断完整性。

2）核酸的保存 ① DNA的保存 pH 影响DNA稳定性 pH7.0~8.0 EDTA 减少二价金属离子 氯仿 防止细菌污染 温度 低温 -70℃ 保存数年 4 ℃保存,10,,② RNA的保存 a 0.3mol／L的醋酸钠或双蒸水，-70℃～-80 ℃若加入RNA酶抑制剂可延长保存时间 b 将RNA沉淀溶于70％乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 ℃可长期保存 小量分装保存,11,第二节 基因组DNA的分离与纯化,一、分离与纯化的方法 1.酚抽提法: EDTA 裂解缓冲液 SDS 裂解细胞 蛋白酶K RNA酶 pH8.0的Tris饱和酚抽提 醋酸铵、无水乙醇沉淀 70％乙醇洗涤 DNA,,,,,,,,12,,13,,2.DNA样品的进一步纯化 方法: 透析、层析、电泳、选择性沉淀 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳,,,14,,二、DNA片段的回收 (一) 原则与要求 1.提高DNA片段的回收率 2.除去回收DNA样品中的污染 (二) 回收方法： 1.DEAE纤维素膜插片电泳法 琼脂糖凝胶 2.电泳洗脱法 3.压碎与浸泡法 聚丙烯酰胺凝胶,,,15,第三节 质粒DNA的提取与纯化,一、提取与纯化 基本过程： 细菌培养 细菌裂解 提取质粒 1.提取方法： 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法 2.纯化方法： 氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法（CsCI-EB法） 聚乙二醇沉淀法,,,16,,裂解细胞 细胞蛋白质、染色体变性 释放质粒DNA 调pH中性 质粒DNA恢复天然结构 沉淀（质粒DNA溶于上清液中） 取上清液 无水乙醇沉淀质粒DNA 70％乙醇洗涤 质粒DNA,,,,,,,,,,,pH12.0~12.6,高浓度盐,17,,,,18,,二、质粒DNA的回收 提取纯化的质粒DNA 凝胶电泳 回收,,,19,第四节 RNA的分离与纯化,rRNA 80~85% tRNA 15~20% 总RNA mRNA 1~5% mRNA 一、RNA制备的条件与环境 RNase 注意：1.细胞外RNase的污染 2. 抑制细胞内RNase,,20,,措施：1.洁净的实验室 2.戴手套与口罩 3.一次性的实验材料和新包装的试剂 4.玻璃器皿用DEPC处理 5.冰浴条件下进行操作,21,,二、总RNA的分离与纯化 （异）硫氰酸胍-酚氯仿一步法 硫氰酸胍+β-巯基乙醇 裂解细胞 酚／氯仿抽提裂解溶液 异丙醇沉淀 75％乙醇洗涤 RNA,,,,,,pH4.0,22,,三、mRNA的分离与纯化 细胞内mRNA特点：含量少 种类多 分子大小不一 mRNA结构特点：多聚腺苷酸尾（polyA） 方法：oligo(dT)-纤维素柱层析法 oligo (dT)-纤维素液相结合离心法,23,,24,第五节 DNA测序,主要方法: 双脱氧末端终止法 Maxam-Gilbert化学降解法 DNA自动化测序,25,,一、双脱氧末端终止法 原理： 模板：单链DNA（待测序的DNA） 酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 引物：5｀端标记的寡核苷酸链 底物：dNTP(AGCT) ddNTP(AGCT),26,,反应体系：四组独立的反应体系 每组均含有dNTP(AGCT) ddNTP(一种) 操作： 1.获得标记片段组 2.电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.显影 4.读序,27,,,28,,29,,二、Maxam-Gilbert化学降解法 待测DNA标记 四组独立反应体系 针对某一种碱基进行切割,30,,,31,,32,,三、 DNA测序自动化 DNA自动测序仪，凝胶电泳、数据收集、序列分析均自动化。

原理：四组反应体系均含有dNTP和 ddNTP及一种荧光标记的引物，并且四组反应体系的引物用不同颜色的荧光染料标记33,,。