基因克隆实验报告.docx

实验单元 6：基因克隆学号 No.： 姓名 Name： 日期 Date： 2014, 04, 26摘要：基因克隆是在体外将目的基因（或其它有意义的DNA片段）同能够自我复 制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究 通过PCR法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的 目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列 本实验应用RT-PCR技术从团头鲂肝脏RNA中扩增B -actin基因cDNA片段，并 克隆到质粒载体pMD18-T，鉴定测序结果显示：只有少数组别成功克隆出目 的基因片段关键词：基因克隆；T-A克隆；团头鲂；B-actin基因一、 前言对 PCR 产物进行克隆是分子生物领域以及基因工程领域中常用的方法，随 着PCR方法应用的多元化，PCR产物的克隆显得尤为重要以前对PCR产物进 行克隆实验，采用的方案大概有以下几种：一是用Klenow酶或单链核酸酶（如 S1核酸酶或绿豆核酸酶）将PCR产物的两端切成平末端，然后克隆到也切成平 端的质粒载体上，或在PCR产物的两端加上人工接头（Linker），经过限制性内 切酶处理以后，再克隆到用相应限制性内切酶酶切产生的载体上；二是在设计 PCR产物时，在引物的）!端引入特异性的内切酶识别序列，在PCR反应结束后， 将 PCR 产物用相应的限制性内切酶进行处理，使之两端产生粘性末端，以便于 克隆到载体的相应酶切位点上［1］。

这两种方法都很烦琐，而且，第一种方法的 克隆效率很低，第二种方法在进行酶切处理时，如果 PCR 产物本身含有相应的 酶切位点时，则有可能切断PCR产物近年来发展了几种PCR产物的直接克隆方法，一种是T4DNA聚合酶补平, 另一种是T-A克隆法其中，T-A克隆法不仅操作简便，而且大大提高了克隆效 率，已经成为克隆PCR产物的主要方法之一但是，在采用T-A克隆法时，随着插入片段长度的增加，克隆效率明显下降，尤其是当 PCR 产物长度大于 3000bp 时，其克隆效率甚至会低于平末端的克隆效率有的学者针对不同长度的 PCR 产 物尝试了不同的T-A克隆法，并且对其克隆效率进行了比较，对不同长度的PCR 产物提出了相对优化的克隆法结果表明，对于较短的PCR产物500bp左右）， 采用常规的 T-A 克隆法即可得到较高的克隆效率；对于中等长度的 PCR 产物 （3000bp左右），用温度循环T-A克隆法可获得较高的克隆效率；对于较长的PCR 产物（6000bp左右），用二次重组T-A克隆法可以提高克隆效率［2］二、 材料与方法2.1 材料实验材料：新鲜的团头鲂肝脏、Trizol、氯仿、异丙醇、75%酒精（用DEPC水和无水乙醇配制）、DEPC水、琼脂糖、Loading Buffer、无RNA酶的枪头（ImL、200口 L、10 口 L）、无 RNA 酶的 1.5mL 离心管、（ImL、200 口 L、10 u L）移液枪、反转录酶、RNA酶抑制剂、oligo引物、反转录buffer、10mmol/LdNTP、无RNA 酶的10 u LPCR管、无菌水、buffer、正向和反向引物、模板、rTaq、dNTP、无 菌10 u LPCR管、DNA纯化试剂盒、pMD18-T、感受态细胞、LB液体培养基（含 氨苄和不含氨苄）、无菌枪头（1mL、200 uL、10 uL）、无菌0.5mL离心管2.2 方法实验流程RNA提取新鲜肝脏组织反转录cDNAPCR目的基因片段放大序列分析2.2.1 RNA 提取（1）先向玻璃匀浆器中加1mL Trizol并放在冰上预冷，取约30-100 mg新鲜组 织至匀浆器中，迅速匀浆至无可见组织块。

将匀浆液转移至2 ml离心管中，室 温静置 5 min2) 向离心管中加入200〜300吐 氯仿(约为RNAiso的1/5体积量)，振荡混 匀至液体不粘稠室温静置5-15 min3) 12, 000 g, 4°C离心 15 min4) 吸取上清液至 1.5ml 离心管中，加入 0.5ml 异丙醇，颠倒数下混匀，室温 静置5-10分钟5) 12, 000 g, 4C离心 8 min,弃上清6) 加入1ml 75%乙醇，轻微振荡数下，12, 000 g, 4C离心5min,弃上清7) 用 75%乙醇重复洗涤一次(可选)8) 室温干燥3-5min (不能完全干燥)加入20~50ul DEPC水溶解，电泳检测 2.2.2 反转录 PCR1总 RNA5 yL + DEPC 水补充到 11 yL2) 20 ymol/L Poly (T)引物 1 yL3) 稍离心后使溶液到管底后，在PCR仪上68C孵育10 min,立即将PCR管插 入冰中,放置 2－5 min4) 继续加入以下组分：M-MLV 5x Reaction Buffer 4 yL10mmol/L dNTP 2 yLRNasin Ribonuclease Inhibitor 1 yL ( 40u)M-MLV Reverse Transcriptase 1 yL ( 200u)用手指轻弹PCR管底部混匀，短暂离心后42CPCR仪中反应1 h。

反应结 束后，可用于下一步实验，抑或保存于-20C冰箱中备用2.2.3PCR反应体系( 50ul 体系)10X buffer5ul25mM MgCl25ulTemplate5ulPrimer F2ulPrimer R2ul2.5 mMdNTP4ulrTaq2ul（若 5 X buffer 则 2ul）程序设置：ddH2O94C3 min94C30 s55C30 s72C30 s72C10 min30 个循环补足至 50ul反应结束后，取2 yL在浓度为1 %的琼脂糖凝胶上电泳检测2.2.4T-A 克隆1） DNA 回收电泳—切胶—胶回收试剂盒电压 电泳液2） 连接pMD18-T vetor 0.5yLSolution I 2.5yL回收的DNA 2-7yL （依浓度而定）灭菌水补充至 10 yL4 °C or 16 °C 连接 0.5-2h3）. 转化、涂平板① 在超净工作台内将连接产物加入含有 100yl 感受态细胞的离心管中反复用 枪头轻吸 2-3 次以混匀然后置于冰中 30min② 从冰中取出离心管，置于42C循环水浴中90s （热激），然后迅速置于冰中2min③ 在超净工作台上，每个离心管加入600卩1 LB液体培养基（不含氨苄），放到 摇床上，37C培养60min,转速不超过100rpm。

此过程主要是让细菌复苏并表 达质粒编码的抗生素抗性基因④ 常温4000 rpm离心1min，吸去部分上清（大约剩100卩1）,留下细胞沉淀， 吹匀后用玻璃棒涂布于含氨苄的平板上（50卩1/个）注：玻璃棒蘸取酒精后，在 酒精灯上烤一下，要稍微放置冷却，以免太热导致细胞死亡涂布时一定要均匀涂开⑤ 把涂布好的平板倒置于37°C恒温培养箱中，至长出肉眼可见大小合适的菌落（一般需要12-16小时）三、实验结果与分析图1团头鲂肝脏总RNA抽提电泳结果图2：团头鲂总RNA的RT-PCR结果图3：菌液检测结果3.1总RNA分离从肝脏中提取总RNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测可见清晰的28S, 18S和5S 3 条带，表明总 RNA 完整性良好（图 1）3.2目的片段RT-PCR扩增和cDNA克隆经RT-PCR扩增可得到团头鲂B-actin基因的cDNA片段（图2）目的片段 经与pMD18-T载体连接后，成功转化到大肠杆菌DH5a阳性克隆的重组子经 蓝白斑筛选，证明外源片段成功插入载体此外，重组子经 PCR 鉴定，得到了 与图 2相同的扩增结果（图3 ） ，证明该质粒是含有外源目的片段的阳性重组子四、 结论部分组别成功克隆了团头鲂的B -actin基因。

在进行蓝白斑筛选的过程中，可能 是由于涂布菌液时玻璃刮铲余温过高且涂布的菌液过多，没有等菌液完全被培养 基吸收就把培养皿颠倒过来，导致只有培养皿的边缘长出菌落，而且单个菌落较 少，只有极少数培养皿长出蓝斑把白斑接种到LB培养基中培养时，部分组别 培养基仍旧澄清，可能是挑菌落时没有挑到 RT-PCR 中，有的组别没有得到 cDNA，可能是本次制作的凝胶太薄，在点样时，样品溢出点样孔，所以没有结 果，也可能是因为操作不当导致RNA降解参考文献[1] .李新波，赵小松，田德志，等.一种PCR产物克隆的新方法一TA克隆法[J].1999, 26（2）:187-189.[2] .李瑞国，安晓荣，苟克勉，等.提高PCR产物TA克隆效率的研究[J].农业生物技术学报，2003， 11（2）: 158-162.。