[精编]山茱萸多糖提取工艺试析论文.doc

山茱萸多糖提取工艺试析论文1器材和方法 1.1材料 供试山茱萸干燥果实产于安徽,购于广州中医药大学大药房有限公司中药饮片厂，将山茱萸原料粉碎,置干燥器中备用 1.2试剂 浓硫酸，质量分数为6%的苯酚(分析纯重蒸馏试剂),质量分数为95%的乙醇,氯仿,正丁醇,葡萄糖,氯化钠等,以上试剂均为分析纯 1.3仪器 核酸蛋白测定仪,德国Hettich公司；自动收样器,美国Whaters公司；AlphaI-2型真空冻干机,德国Christ公司；电热恒温水槽(DK8D型),上海森信实验仪器有限公司；高速冷冻离心机,德国Hettich公司 1.4方法 1.4.1粗多糖样品的制备 山茱萸干粉,不同条件加热(搅拌)浸提,离心,上清液加热浓缩至体积的1/4,95%乙醇沉淀至75%(V/V)，4℃静置过夜,离心,取沉淀,丙酮乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空冷冻干燥得到粗多糖样品 1.4.2山茱萸多糖含量测定［4］ 采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖为标准单糖制作标准曲线，得回归方程为：Y=0.0077X+0.0257,R2=0.9995［多糖的量（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标］。

准确称取粗多糖样品6mg,加蒸馏水至50ml,配成120μg/ml的样品溶液吸取样品液1.0ml，按标准曲线同法操作，测光密度，以标准曲线计算总糖含量 1.4.3得率的计算山茱萸多糖得率(%)=山茱萸粗多糖样品中总糖含量(g)/山茱萸原料质量(g)100% 1.4.4单因素分析及正交实验 本实验选取温度、时间、料液比、pH值这4个因素进行分析,并从中选取3个因素水平根据单因素分析结果,采用L9(34)表做正交实验,以多糖提取率作为衡量提取效率的客观指标，以确定最佳提取工艺 1.4.5山茱萸多糖的分离纯化 按最佳提取工艺流程,将提取的红褐色山茱萸粗多糖(ZA)复溶于水,用Sevag［5］法除蛋白,重复3次,加95%乙醇至30%,离心,得到粗多糖(ZB),上清液继续加95%乙醇至60%,4℃静置过夜,丙酮-乙醚-无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空冷冻干燥,得到粗多糖样品(ZC)称取样品AC200mg,溶于100ml蒸馏水中,然后加到DEAE-cellulose-52离子交换柱洗脱(2.6cm26cm)上,依次用蒸馏水及0.1，0.3，0.5，0.8，1.0mol/L的NaCl水溶液洗脱,多功能电子蠕动泵控制流速为1ml/min,用自动收集仪收集,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,合并各吸收峰的洗脱液,蒸馏水透析3d，旋转蒸发仪浓缩,冷冻干燥,得到山茱萸多糖的两个分离产物S1和S2。

1.4.6纯度测定 凝胶色谱法:用0.05mol/LNaCl溶液充分溶胀葡聚糖凝胶SephadexG200,超声脱气,搅拌均匀,沿玻璃棒小心缓慢地加入到柱中,同时用洗耳球敲击柱壁,使填料沉降均匀、紧密柱型(2.6cm33cm)，装柱完成后,用0.05mol/L的NaCl溶液平衡48h称取经DEAE柱分离得到的多糖样品20mg,溶于0.05mol/L的NaCl溶液中,加入到SephadexG-200凝胶柱中,洗脱液控制流速为0.1ml/min,用自动收集仪收集洗脱组分,2ml/管,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,观察吸收峰形状,若峰对称,说明样品较纯,若峰形不对称,说明样品不纯,需要进一步分离纯化,方法同上 1.5山茱萸多糖理化性质 1.5.1物理性质 山茱萸多糖的颜色、形状、水溶性、有机溶剂的溶解性等 1.5.2化学性质［6］ Molish反应,硫酸-苯酚反应,Fehling试剂反应,碘-碘化钾反应，三氯化铁反应 1.5.3蛋白含量测定考马斯亮蓝法:以牛血清白蛋白制备标准蛋白质溶液，以OD595值为纵坐标,蛋白的量为横坐标做标准曲线：Y=0.0039X+0.0032，R2=0.9993。

1.5.4多糖基本元素分析 通过CHNS/O元素分析仪来确定纯化后山茱萸多糖中基本元素的组成 2结果 2.1山茱萸多糖提取条件的单因素分析 2.1.1乙醇添加量山茱萸多糖得率随乙醇添加量增加而增加,乙醇添加倍数达到3倍时，多糖沉淀完全,所以本研究以下的实验均选用3倍体积乙醇沉淀多糖 2.1.2提取温度温度是影响多糖得率的重要因素不同温度(40，50，60，70，80，90℃)对多糖得率产生影响:多糖得率随温度升高而升高,40～60℃升高较慢60～80℃较快,80℃达到最高值,因此确定正交实验温度3水平为60，70，80℃ 2.1.3提取时间提取时间是影响多糖得率的另一个重要因素,不同时间(1，2，3，4，5，6h)对多糖得率的影响如图3所示多糖得率随时间升高而升高,1～3h升高较慢,3～5h升高较快,因此确定正交实验提取时间水平为3，4，5h 2.1.4加水量不同加水量(30，40，50，60，70，80倍)对多糖得率的影响如图4所示多糖得率随加水量增加而增加30～50倍水升高较慢,60～80倍水升高较快,因此确定正交实验加水量的水平为60，70，80倍水。

见图4 2.1.5pH值不同pH值(1～7)对多糖得率的影响见图5在酸性条件下多糖得率明显降低,pH>3时对多糖得率影响不大,可能在强酸环境下,多糖被降解,并且水提法成本低,所以酸提山茱萸多糖意义不大 2.2正交实验 根据以上的单因素实验分析,确定L9(34)表的3个因素温度、时间、料液比的3个水平结果见表1表1正交实验的因素及水平（略） 正交实验确定最佳提取条件结果见表2表2正交设计及实验结果（略） 由表2得知,3种因素对多糖得率的影响程度为A(温度)>B(时间)>C(加水量),水提法提取山茱萸多糖的优方案是A3B3C1由表3方差分析和F检验得知,在95%可信程度下A和B对多糖得率的影响显著,C没有显著性影响,三者对本实验的影响程度与极差分析结果一致表3正交设计实验结果方差分析（略） 2.3山茱萸多糖的分离纯化按最佳提取工艺流程,提取的山茱萸粗多糖ZA,经Sevag法脱蛋白,由多糖得率看在脱蛋白过程中造成了多糖的同步损失,损失率在8%左右,可能和含有糖蛋白有关系脱蛋白后经丙酮-乙醚-无水乙醇溶剂系统反复冲洗后,继续分级醇沉得到ZB和ZC,因预实验显示ZB抗氧化活性和免疫活性要明显小于ZC,因此将ZC200mg过DEAE-52纤维素离子交换柱,得到3个样品S15.2，S2118.6mg和S311.2mg(S1和S3量少未做研究)。

见图6采用SephadexG-200对S2进一步纯化,洗脱曲线见图7经浓缩,透析,冷冻干燥,得到进一步纯化的多糖样品S21由图7看出S11为单一对称峰,说明其组分均一 2.4山茱萸多糖理化性质分析 ZA，ZC，S2和S21见表4经元素分析仪测定多糖S21中含C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未检出表44种多糖理化性质（略） 3结论 山茱萸多糖经单因素实验和L9(34)正交实验,得出其最佳提取工艺条件是:提取温度80℃，料液比1∶60，提取时间5h,在此条件下山茱萸多糖得率是13.8%,经用Sevag法脱蛋白、丙酮-乙醚-无水乙醇溶剂系统反复冲洗、分级醇沉、DEAE-52纤维素离子交换柱层析法和SephadexG-200凝胶柱层析法对其进行分离纯化得到组分S21,经元素分析仪测定C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未检出本实验对山茱萸多糖提取工艺,理化性质等进行了初步研究,为以后深入研究奠定了基础 【参考文献】 ［1］潘扬,王天山.植物山茱萸化学成分的研究概况［J］.南京中医药大学学报，1998,14(1)：61. ［2］魏淑梅,崔玉海.山茱萸多糖的分离纯化及活性研究［J］.黑龙江中医药,2006,19(4)：249. ［3］李平，王艳辉，马润宇.山茱萸多糖PFCAⅢ抗氧化性能研究［J］.北京化工大学学报，2003,30(3)：35. ［4］张维杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海:上海科学技术出版社，1987：296. ［5］齐慧玲，魏绍云，王继伦，等.Sevag法去除白及多糖中蛋白的研究［J］.天津化工，2000,3：20. ［6］李建武,余瑞元，陈丽蓉，等.生物化学实验原理和方法［M］.北京：北京大学出版社，1994：125. 【摘要】通过单因素和正交实验,以多糖得率为指标,确定山茱萸多糖的最佳提取工艺,同时对山茱萸多糖理化性质进行分析,结果表明，山茱萸多糖最佳水提工艺条件:温度80℃，料液比1∶60，时间5h,在此条件下山茱萸多糖得率是13.8%,经DEAE-52纤维素离子交换和SephadexG-200柱层析法得到组分S21,经元素分析仪测定C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未检出。

【关键词】山茱萸多糖;提取；分离纯化；理化性质6 1、最灵梦想是一个天真的词，实现梦想是个残酷的词21.2.172.17.202105:5105:51:312月-2105:512、只有收获，才能检验耕耘的好处；只有贡献，方可衡量人生的价值二〇二一二〇二一年二月十七日2021年2月17日星期三3、不要放弃，你要配的上自己的野心，也不要辜负了所受的苦难05:512.17.202105:512.17.202105:5105:51:312.17.202105:512.17.20214、找一个理由，否认忧伤，笑容就会灿烂到无所不在2.17.20212.17.202105:5105:5105:51:3105:51:315、成功与不成功之间有时距离很短——只要后者再向前几步二月 21星期三, 二月 17, 20212/17/20216、只要努力抬起你的双脚，胜利将属于你5时51分5时51分17-2月-212.17.20217、青春如此华美，却在烟火在散场21.2.1721.2.1721.2.172021年2月17日星期三二〇二一二〇二一年二月十七日8、真正没有资格谈明天的人，是那个不懂得珍惜今日的人。

05:5105:51:312.17.2021星期三, 二月 17, 20211、你始终不属于我，属于我的只是我自己21.2.172.17.202105:5105:51:312月-2105:512、一份信心，一份努力，一份成功；十分信心，十分努力，十分成功二〇二一二〇二一年二月十七日2021年2月17日星期三3、你是唯一的，你是十分独特的，你就是你生命中的第一名05:512.17.202105:512.17.202105:5105:51:312.17.202105:512.17.20214、要跟成功者有同样的结果，就必须采取同样的行动2.17.20212.17.202105:5105:5105:51:3105:51:315、我们的生命，就是以不断出发的姿势得到重生二月 21星期三, 二月 17, 20212/17/20216、只要站起来的次数比倒下去的次数多，那就是成功5时51分5时51分17-2月-212.17.20217、自知之明是最难得的知识21.2.1721.2.1721.2.172021年2月17日星期三二〇二一二〇二一年二月十七日8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱05:5105:51:312.17.2021星期三, 二月 17, 202。