亚硫酸盐还原菌及检测.docx

亚硫酸盐还原菌及检测一、 生物学特性与卫生学意义亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌是梭状芽胞杆菌属的一群细菌，而不是一个生物 学分类单位多指厌氧芽胞杆菌，代表性菌株是致黑梭状芽胞杆菌，其他常见的 还有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌等此类细菌的主要特征是将亚硫酸 盐还原为硫化物，多为有动力的革兰氏阳性菌，可形成芽胞，厌氧生长厌氧亚硫酸盐还原菌的孢子在自然环境中广泛存在，通常出现在人和动物的 粪便排泄物，废水和土壤中与大肠杆菌和其它杆菌不同的是，由于它们的孢子 比营养体对物理和化学因子具有更强的抵抗力，所以可以在自然环境中存活很大 时间因而，通常将他们作为长期污染或间断污染的指示菌它们甚至可以抵抗 正常水处理所用氯的工作浓度，因此，它们对判断是否已达到控制目的非常有用由于此类细菌抵抗力强，即使在经适当加工处理的加工食品中其芽胞仍会存 活，条件适宜时又会生长繁殖，造成食品品质降低或腐败，甚至会引起食物中毒 的危险因此在食品的制备、贮存以及食品加工厂环境卫生控制上颇受重视，作 为食品、矿泉水、加工设备卫生、生产环境的卫生状况的评估指标，正确得到越 来越广泛的应用该类细菌的检测多用于环境水质和生活饮用水污染状况的评估，在九十年代 中后期开始在食品卫生领域中有所要求，但多局限于欧洲国家和地区，如法国、 瑞士、英国、捷克等欧盟成员国。

到目前为止，该菌一般不被作为食品卫生常规 检测项目和致病菌检测内容，我国和美国未将该检测项目列入食品微生物检测项 目和要求中二、 检测方法由于此类细菌以形成芽胞、厌氧生长和还原亚硫酸盐为硫化氢为主要特征， 往往无需作进一步实验验证，因此在检测中将满足以上三个条件的一群细菌全部 认定为厌氧亚硫酸盐还原菌检测方法一般包括以下三部分：检样在接种前在80-100°C水浴中处理10-15 分钟，以杀灭抵抗力弱的芽胞细菌的营养体，同时刺激芽胞的繁殖；通过选择性 培养如亚硫酸铁盐琼脂等判定是否具有还原亚硫酸盐的能力，如果有则进一步与 培养基中的亚铁盐如枸橼酸铁反应，使菌落呈现黑色；培养基接种后置于厌氧环 境中培养确认厌氧特征也可在培养基中加入抗生素等抑制剂抑制其它非亚硫酸 盐还原菌的生长下面详细介绍亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌的检验方法1. 培养基和试剂1.1氯化钠胰蛋白胨稀释液1.2亚硫酸铁琼脂1.3过氧化氢试剂2. 仪器和设备2.1均质器:用于处理固体样品2.2培养罐(箱)，带产生厌氧环境的设备或试剂2.3恒温培养箱:37±1°C或46±1°C2.4振荡器2.5 吸管：1mL、10mL，具 0.1mL 刻度2.6培养皿:直径为90mm2.7稀释瓶:容量为500mL和250mL的广口瓶2.8天平:感量0.1g3. 抽样和试样制备3.1抽样参照SN0330-94规定抽样3.2试样制备无菌操作称取剪碎后的样品25g,置于装有225mL氯化钠胰蛋白胨稀释液的 广口瓶中。

若检测亚硫酸盐还原梭菌的芽胞，可75C 20min或煮沸保持10min 热处理样品，之后以流水迅速冷却全室温后再称取充分混匀后据样品污染情况 做进一步的系列十倍梯度稀释4. 检验步骤与计数4.1菌落计数法适用于检查未经加工处理的生鲜食品及亚硫酸盐还原梭菌计数＞10g(mL )的 食品4.1.1接种和培养4.1.1.1对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸 取1 mL，一式双份地接种于每个灭菌的培养皿中4.1.1.2倾注约15 mL制备好的并于水浴箱保温至45^的亚硫酸铁琼脂从制 备最初稀释液结束到倾注培养基于最后一个平皿所用的时间不应超过15min仔 细将接种物和培养基充分混匀，水平放置，使其凝固4.1.1.3待混合物凝固后，在倾注10 mL同样的培养基于已凝固的培养基上作为 隔层以防氧吸附，并防止细菌蔓延生长4.1.1.4待该隔层凝固后反转制备好的平板，于37±1°C厌氧培养24-48h若对 培养温度有特殊要求（如46C），可依据情况进行培养4.1.2计数4.1.2.1亚硫酸盐还原梭菌在亚硫酸铁琼脂上呈暗灰色或黑色菌落37±1C厌 氧培养24h后，计数典型的菌落；若平板上无特征性菌落或菌落较小（＜0.5mm）， 则需继续培养24h再计数；若48 h后的菌落增大以全相连，则以24 h的计数为 准，反之则以48h为准。

那些仅产生氢（而不是H》）的厌氧菌生长时也可还原亚硫酸盐而导致培养 基出现弥散的、非典型的普遍变黑，这种现象不应计数4.1.2.2取特征性菌落（不少于5个）移种于疱肉培养基中，37±1C厌氧培养 24-72 h待出现生长特征（培养液浑浊、产气、出现异味）后，按5条进行证 实试验对阳性结果进行计数4.1.2.3读取带有10-100个黑色菌落的平皿，结果以相应稀释度的两个平板的 菌落数平均值乘以相应稀释倍数来计算每克样品中亚硫酸盐还原梭菌数结果报 告如下：估计亚硫酸盐还原梭菌数/g（mL）若相应测试试样的两个平板上均无特征性菌落，以＜10/g（mL）报告4.2最近似值（MPN ）法适用于检查亚硫酸盐还原梭菌计数忍10 g（mL）及含有受损伤的亚硫酸盐还 原梭菌的加工食品4.2.1接种和培养4.2.1.1 增菌选用适宜的三个连续稀释的样液，从每个样液中分别吸取1mL，一式三份地 接种于3管装有疱肉培养基的试管中，接种后上面覆盖一层无菌的液体石蜡，37 ±1C培养24-72h待出现生长特征（培养液混浊、产气、出现异味）后按5.1 条进行镜检反之，则报告阴性4.2.1.2分离培养取4.2.1.1增菌培养物1mL置于灭菌的培养皿中，倾注约15mL45°C的亚硫 酸铁琼脂。

仔细将接种物和培养基充分混匀，待其凝固后，再倾注10mL同样的 培养基作为隔层，于37±1C厌氧培养24-48h生成的暗灰色或黑色菌落，按5 条加以证实；反之，则报告阴性4.2.2结果计算4.2.2.1计数每个稀释度得到的阳性反应管数4.2.2.2利用MPN表，由阳性管数估算每克(毫升)试样中亚硫酸盐还原梭菌最 近似值结果报告如下：估计亚硫酸盐还原梭菌数/g(mL)5. 证实试验5.1形态观察取疱肉培养物涂片，镜检，作革兰氏染色，检查培养物细菌形态亚硫酸盐 还原梭菌为革兰氏阳性杆菌，单个散在，成对、成小链状或并列地聚堆存在产 芽胞时，芽胞呈卵圆形或球形，位于中央、次终端或终端5.2过氧化氢酶试验在洁净载玻片上滴1滴培养物，再滴加1-2滴3%的过氧化氢出现小气泡说明有过氧化氢酶活性亚硫酸盐还原梭菌不形成过氧化氢酶附录：A1氯化钠胰蛋白胨稀释液将8.5g氯化钠和1.0g胰蛋白胨溶解于1000 mL蒸馏水中调节pH至7.2 ±0.1分装225 mL于250 mL广口瓶中，121C高压灭菌15minA2亚硫酸铁琼脂胰蛋白胨15.0g大豆蛋白胨5.0g酵母浸膏5.0g偏重亚硫酸钠1.0g柠檬酸铁铵1.0g琼脂20.0g蒸馏水1000g将各成分混匀，加热溶解，调节pH至7.6±0.1,分装于500 mL锥形瓶中 各250 mL，121°C高压灭菌15 min。

一周内用完A3疱肉培养基牛肉浸液1000 mL蛋白胨30.0g酵母浸膏5.0g磷酸二氢钠5.0g葡萄糖3.0g可溶性淀粉2.0g碎肉渣适量取碎肉渣分装15mmX 150mm试管约2-3cm高，将上述液体培养基分装至每管 内超过肉渣表面约1 cm121C高压灭菌15 minA4过氧化氢酶试验挑取培养物一接种环，置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液(临用时 配制)2mL，于半分钟内观察发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性耶尔森氏菌及检验耶尔森氏菌属包括11个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔 森氏菌、假结核菌和鼠疫菌只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食 源性病原体鼠疫耶尔森氏菌引起黑疽病，不通过食品传染1981年根据DNA以及生化和形态特征的相关资料，与小肠结肠炎耶尔森氏 菌极为密切3个同源群被作为耶尔森氏菌的新种命名，它们是弗氏耶尔森氏菌 (Y • frederiksenii)、中间型耶尔森氏菌(Y • intermedia)和克氏耶尔森氏 菌(丫 • krislensenii)一、生物学特性1、形态特性本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为1-3.5X0.5-1.3〃m,多单个散在， 有时排列成短链或成堆。

本菌不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛；但其鞭毛在30r 以下培养条件形成，温度较高时即丧失，因此表现为30 r以下有动力，而35 r 以上则无动力2、 培养特性本菌生长温度为30-37°C，但在22-29r才能使本菌的某些特性出现4°C时 能保存和繁殖本菌世代时间长，最短亦需40分钟左右在SS或麦康凯琼脂上 于25C经24小时培养，菌落细小，至48小时直径才增大成0.5-3.0mm菌落圆 整、光滑、湿润、扁平或稍隆起，透明或半透明；在麦康凯琼脂上菌落淡黄色， 如若微带红色，则菌落中心的红色常稍深本菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般 不形成菌膜3、 生化特性表一：本菌的生化特性及其与近缘菌的鉴别反应鼠疫耶氏菌假结核耶 氏菌小肠结肠炎耶氏菌中间型耶 氏菌费氏耶氏菌克氏耶氏菌赖氨酸------精氨酸------鸟氨酸--++++动力(22-26C)-+++++动力(35-37C)------尿素-+++++苯丙氨酸脱氨基酶------甘露醇++++++山梨醇+/--++++纤维二糖--++++核糖醇------肌醇--+/-+/-+/-+/-蔗糖--+++-鼠李糖-+-++-棉子糖-+/--+--蜜二糖-+/--+--枸橼酸盐---+/-+/--V-P--+/-++-吲哚--+/-+++/-水杨甙+/-+/-+/-++-/+七叶甙+++/-++-脂酶--+/-+/-+/-+/-毗嗪酰胺酶--+/-+++4、生物型小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型分类方法有几种，目前FDA细菌分析手册第 八版中采用的是Wanters 1981的分型方。