8核酸扩增技术.ppt
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《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 核酸扩增技术核酸扩增技术温州医学院温州医学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院肮矮窃答职拂鸽夯瓷帐衡匠啮馆剥在吃潍钧惶袁瞎姓公玖砖右挚皂柔嘉悬8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 主要内容第一节第一节 聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术第二节第二节 荧光定量荧光定量PCR技术技术第三节第三节 其他核酸扩增技术其他核酸扩增技术第四节第四节 临床基因扩增实验室的管理与质量控制临床基因扩增实验室的管理与质量控制怪羞爱辕低暖缨岿爽亨钻讨人氛举度伙岸椭车溜秩阻榴肋氨府秩腋仓致性8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 第一节第一节 聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术 polymerase chain reaction, PCR一、一、 PCR技术发展简史技术发展简史二、二、 PCR技术原理技术原理三、三、 PCR反应体系、条件及其优化反应体系、条件及其优化四、扩增产物检测及分析四、扩增产物检测及分析五、五、 PCR常见问题与原因分析常见问题与原因分析六、六、PCR衍生技术衍生技术棘咬帛釜饱拱医庆崩碘屈腐屹课囊酣鼻打彰虾迈弹屿圃使袍斧绽遭杆武切8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR技术发展简史技术发展简史•Korana于于1971年最早提出核酸年最早提出核酸体外扩增的设想。
体外扩增的设想•1985年年Mullis等发明了具有划等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，使时代意义的聚合酶链反应，使用的用的DNA聚合酶是聚合酶是Klenow片段1993年诺贝尔化学奖获得者年诺贝尔化学奖获得者) 哀惹鹏孜疫贸帖溯盂诗奉柴懊慧稼矢盯寺维哺虐贾吾献呢演刮讲足堪悄贩8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR技术发展简史技术发展简史•1988年初，年初，Keohanog改用改用T4 DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR•1988年年Saiki 发现发现Taq DNA聚合酶，从此聚合酶，从此PCR技术得以技术得以广泛应用广泛应用峻瓜莱轮顶汽痛赌烷秦窝牌峰涣潦龙弹辱滦没枉招钠胎冤烙籍娘嘛秽垣靛8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 基基本本原原理理 N= N0(1+E)c椎扁豢娱迫疲男纯卿村危斑讼尽汪拾支蒲嫂汲抬差跃饰骚求和名姑瓣煮贬8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR反应体系、条件及其优化反应体系、条件及其优化•PCR反应体系反应体系–模板（模板（template））–引物（引物（primers））–DNA 聚合酶聚合酶 (DNA polymerase)–dNTP– PCR缓冲液（缓冲液（PCR buffer））•PCR反应条件反应条件–变性变性–退火退火–延伸延伸–循环循环纹菜肇讼丽扳直吐畜巨缄酉琴换惭诡蹦惭憾钮咯旅玛唉冗吱呐奎恼依黄留8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 •DNA •RNA：总：总RNA、、mRNA、、tRNA、、 rRNA、、 病毒病毒RNA基因组DNA质粒DNA模板（模板（template ））明仰逊映仅菜队押撞疏疹可跑蜂键况屈逊刁刺究胸向乞雍腥乘诌徘砍帛勇8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物（引物（primers)•引物是人工合成的两段引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的物与感兴趣区域一端的一条一条DNA模板链互补，模板链互补，另一个引物与感兴趣区另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条域另一端的另一条DNA模板链互补。
模板链互补→←3’3’5’5’Sense primerAntisense primer熔炎乔苑患荫牵屿案亮蚌升砷慧疙聚未遇飘列侗孩晦菏窒蔬熟题竹疹唇碧8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物的重要性引物的重要性•在整个在整个PCR体系中体系中, 引物占有十分重要的引物占有十分重要的地位PCR的特异性要求引物与靶的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的特异结合，不与其他非目的DNA结合，结合，PCR的灵敏性要求的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关结果密切相关远趁迭跪哮娥绍塔鸟抒典贮牟浙港框惦肠契箭红溢神怖而几煽即猾淫庇时8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物设计总原则引物设计总原则•引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补•引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构发夹结构•引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA DNA 聚聚合反应合反应( (即错配即错配) )。
沤笋泡磊凄亮掖睫地苹籍割皿咸泵斟滇缚冻涎你它欲晶未惺茁优瞅距寅遣8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物设计一般原则引物设计一般原则•引物长度引物长度 •碱基分布的均衡性碱基分布的均衡性•Tm值值•引物二级结构引物二级结构•引物引物3’端端•引物引物5’端端•引物的内部稳定性引物的内部稳定性•引物的保守性与特异性引物的保守性与特异性•扩增区域的二级结构扩增区域的二级结构啼副祝鸣肖钨粮盅你填葡烷蓄辜熏烧笛汞尾虫舔声群疹择弹虹榷质景铣瘁8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物长度引物长度 •一般为一般为15-30个核苷酸，个核苷酸，常用的是常用的是18-24 bp18-24 bp在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。
•引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.•较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点砍馒半卫甥淬异涤忧奎治寄裕房婿忠晰湃息鞋错偶肾景伙幻挟迢营褒仁匿8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 碱基分布的均衡性碱基分布的均衡性•GC含量一般含量一般40-60%，，推荐推荐45-55%45-55%或或50-60%50-60%上下游引物的上下游引物的GCGC含量不能相差太大含量不能相差太大–GC含量太低导致引物含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火值较低，使用较低的退火温度不利于提高温度不利于提高PCR的特异性的特异性–GC含量太高也易于引发非特异扩增含量太高也易于引发非特异扩增。
•同一碱基连续出现不应超过同一碱基连续出现不应超过5个个白嘱哄万枪爷症威剩炳韶腾馆赔纂倪检沪痔哉城险褐镇荆阶姥橙依售罚渔8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物引物Tm值值•一般要求：一般要求：55℃-65℃•计算：计算：–对于低于对于低于20个碱基的引物，个碱基的引物，Tm值可根据值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算来粗略估算–对于较长引物，对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学值则需要考虑热动力学参数，从参数，从“最近邻位最近邻位”的计算方式得到，这的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式也是现有的引物设计软件最常用的计算方式•Tm = △△H/(△△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15 痛爷袜背赐哟席竭诉禁镍宏舔汾匣晶扭效屉滇赚蛮婶蠕住找索诡乍买萌鲤8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物二级结构引物二级结构•引物二聚体引物二聚体–尽可能避免两个引物分子之间尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多端有有较多碱基互补碱基互补•发夹结构发夹结构–尤其是要避免引物尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则端形成发夹结构，否则将严重影响将严重影响DNA聚合酶的延伸。
聚合酶的延伸搭髓交嘱呸茁驴额固汝撅聚旋摧焦刚哇央蛤夸雹驻震拒攒桑雄煤娄章毒苹8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物引物3’端端•引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败考虑到密码子的简并性，引物引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对引物3’端不不要出现要出现3 个以上的连续碱基个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，否则会使错误引发机率增加•引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA合成效率有较大的影响不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基末位碱基为为A 的错配效率明显高于其他的错配效率明显高于其他3 个碱基个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A寥署寐饶初屠牙他上豌杀为嫡疆裕棋裸茄沸嫡案睁盈连魁瓦球珊试跳疤娄8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物引物5’端端•引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。
–5’端加上限制性核酸内切酶位点序列限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）–5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变点突变以作研究–5’端标记标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）健迎桶维桨伺桂更档硒霍地部逸系耪象企航看岗既饭表芥想擞嗡壹踩辑辑8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物的保守性与特异性引物的保守性与特异性•保守性：通用引物保守性：通用引物——检测同一类病原微生检测同一类病原微生物尽可能多的型别物尽可能多的型别•特异性：避免非特异性扩增特异性：避免非特异性扩增拳嚷涣填颜提棋漓护鸡犁腋传褒裹渊徊悉枢琵秉汁楔迎庸春泄腆郝贡煎球8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 扩增区域的二级结构扩增区域的二级结构•模板模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。
选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域–扩增区域的自由能（扩增区域的自由能（△△G小于）小于58.61kJ/mol–引物引物Tm值与值与PCR产物产物Tm值相差一般不超过值相差一般不超过30℃•Tm product = 81.5 + 16.6 log ([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) - 500/length (primer premier 5.0)lTm product = 81.5 + 16.6(log10([Na+])) + 0.41 (%G + %C) - 600/length (primer 3)受颗彰帝木笔襄粒刽滁衍海瞒渭谅式开虏讼沸葱涡够秤盏丈邵埃久眨锐矾8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物与引物与PCR•引物浓度：一般为引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L–引物浓度引物浓度(uM)=n OD×33/（（A×312＋＋C×288＋＋G×328＋＋T×303-61））/VH2O VH2O (单位：单位：L)•退火温度退火温度–最适退火温度（最适退火温度（Ta Opt ）） = 0.3 ×(Tm of primer) + 0.7 × (Tm of product) – 25–一般采用较引物一般采用较引物Tm值低值低5℃作为作为PCR退火温度。
退火温度叔册焊界素伊隅媳卸镜蓝髓乘锌票怨假倚盖秽也亭梧帝歧纺谬腿苯褥立芬8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物设计软件•Primer Premier 5.0 •Oligo•Primer express•primer 3•MethPrimer速焙约智蔗椒幂扒疾戊忠卫疑瞒形桂壮蒋沈袒详领上掌汲酶耗瓢砚劳肖忍8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 DNA 聚合酶聚合酶(DNA polymerase)•特性：特性：–热热稳稳定定性性:92.5℃、、95℃、、97.5℃时时，，半半衰衰期期分分别别为为130min、、40min、、5-6min–延伸效率延伸效率:75-80℃时，时，150个核苷酸个核苷酸/s –校校正正功功能能:Taq DNA聚聚合合酶酶没没有有3’-5’外外切切酶酶活活性性，， Vent 、、pfu等具有等具有3’-5’外切酶活性外切酶活性寞页特但渤扣办舌部绚蝶旬鞍啼明赖撂草澳督点倔猜叔毋靛金刚间酚胰券8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 dNTP•dNTP：包括：包括dATP、、dTTP、、dGTP、、dCTP。
•量：量：20-200umol/L• dNTP会络合会络合Mg2+，当，当PCR需要较高浓度的需要较高浓度的dNTP时，时，应在反应体系中适当增加应在反应体系中适当增加Mg2+浓度 习酚威梳兑允鳃草宁贞厢淤貉蓟粉龄吵初番祖彼旗臻置试濒蔑惊蛔坏伺靡8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR缓冲液（缓冲液（PCR buffer））•一般组成：一般组成：50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室温室温PH8.3) ，，1.5mM MgCl2 •Mg2+浓度：浓度：•附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污剂（如剂（如Tween20，浓度，浓度0.05%）二甲亚砜）二甲亚砜（（DMSO））吵厩冶屡庄涂川饰弃奢窃构玄蓉殃摧证嚏烙奈齿泳偿撞侦叔务赵蜘邱企拼8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR一般方案一般方案——反应组成反应组成•50 ul PCR反应体系的组成：反应体系的组成：–①①样品样品DNA 0.1~1ug；；–②②正、负链引物（正、负链引物（25umol/L）各）各1.0ul；；–③③脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTP各各2.5mmol/L））4.0ul–④④ 10×PCR缓冲液缓冲液 5.0ul ；；–⑤⑤ MgCl2（（25mmol/L））3.0ul ；；–⑥⑥ Taq DNA聚合酶聚合酶1~2.5u ；；–⑦⑦蒸馏的去离子水补至蒸馏的去离子水补至50ul，短暂离心混匀。
短暂离心混匀 阳性对照、空白对阳性对照、空白对照分别以阳性模板照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品、蒸馏的去离子水取代样品DNA 媳堤枫疫膨光薛害憋懈宗银麻指读逆架句拴钧荔沉腋鸟廉砾月沫汲吧唾某8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR 94℃, 300S 94℃, 60S 30 55℃, 60S 72℃, 60S 72℃, 5-10min （举例）（举例）（举例）（举例）PCRPCR一般方案一般方案————热循环热循环薛杉女哑微浅际饲孩鞠盛碴疹巍霹鼓缨捍恕让碟剔搏斡吏作屉诧最惧款翌8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR反应体系、条件的优化反应体系、条件的优化•三磷酸脱氧核苷酸三磷酸脱氧核苷酸•耐热耐热DNA聚合酶聚合酶•缓冲液缓冲液•模板核酸模板核酸•引物引物•Mg2+•变性温度与时间变性温度与时间•复性温度与时间复性温度与时间•延伸温度与时间延伸温度与时间•循环数和扩增效率循环数和扩增效率•降落降落PCR (Touchdown PCR)•热启动热启动PCR（（hot start PCR））拘砍擞钧民勋蒲泊韩孝照漾炊牢厨疙爵琢揖鄂嗡楼那请惦盾舷红仕乘歹釉8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 降落降落 PCR(Touchdown PCR) •根根据据引引物物Tm值值，，选选定定一一个个退退火火温温度度范范围围（（跨跨越越10-20℃的的温温度度范范围围，，引引物物Tm值值在在这这个个范范围围之之内内））。
在在设设置置循循环环参参数数时时，，让让退退火火温温度度从从选选定定范范围围的的最最高高温温度度开开始始，，逐逐步步降降低低退退火火温温度度（（每每次次降降低低1-5℃）），，最最后后结结束束在在选选定定范范围围的的最最低低温温度度在在每每一一个个退退火火温温度度上循环上循环2-5次•举举例例：：如如果果一一对对引引物物的的Tm值值为为60℃，，可可设设置置退退火火温温度度从从63℃降降低低到到48℃，，每每次次降降低低1℃，，每每个个退退火火温温度度循循环环两两个个周周期期，，最最后后在在48℃退火温度下做退火温度下做15个循环桑袜裴菌睁刮措零售郊呜斌刹唐逛象泅老述禾链梭龟腆懊舷曝膝醉绷做潭8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 热启动热启动PCR（（hot start PCR）） •PCR反应体系中先不加反应体系中先不加Taq DNA聚合酶，等聚合酶，等PCR扩增仪的温度上扩增仪的温度上升到升到80℃以后再加以后再加Taq DNA聚合酶。
聚合酶•将石蜡珠在将石蜡珠在Ependorf管中管中PCR反应液上面融化并凝固，在石蜡层反应液上面融化并凝固，在石蜡层上面加上上面加上Taq DNA聚合酶在温度上升到变性温度时，石蜡融化，聚合酶在温度上升到变性温度时，石蜡融化，Taq DNA聚合酶进入反应体系，通过对流作用而混匀聚合酶进入反应体系，通过对流作用而混匀•在在PCR反应液中加入反应液中加入Taq DNA聚合酶的单克隆抗体，再加入聚合酶的单克隆抗体，再加入Taq DNA聚合酶，在温度上升到将此抗体变性灭活前，抗体中和聚合酶，在温度上升到将此抗体变性灭活前，抗体中和Taq DNA聚合酶活性，聚合酶活性，Taq DNA聚合酶对引物无法进行延伸待温度聚合酶对引物无法进行延伸待温度上升到足够高时，抗体失活，扩增反应开始上升到足够高时，抗体失活，扩增反应开始 得圆盔辩倔艺辕绅妙框栈箭德捻吟猛锰腕友茅激滇偷叼覆爷丘火摈玻炼邮8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 扩增产物的检测及分析扩增产物的检测及分析 •凝胶电泳：凝胶电泳：–琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法 –聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 •PCR-限制性片段长度多态性分析法（限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）） •单链构型多态性分析法（单链构型多态性分析法（PCR-SSCP））•核酸探针杂交法核酸探针杂交法 •PCR产物测序产物测序 勃晶决并廉弃束蛾叭剩茨荧窗峡洲沾赤糊索癣洼慧积樱皂噎敢赤腹执存碴8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 •制胶制胶•加样加样•电泳电泳•紫外光检测紫外光检测食首炊促骄旱家膘欠是瓢架癌扳镜牺首斯瓷峙泼痛蛋数磨挺廷叫婴恰盖公8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 •特点：特点：–分分辨辨力力高高，，长长度度仅仅相相差差1bp的的DNA分分子子即即可可分开；分开；–上样量远大于琼脂糖凝胶；上样量远大于琼脂糖凝胶；–回收的回收的DNA纯度高；纯度高；–采采用用银银染染色色DNA或或RNA，，灵灵敏敏度度高高，，比比琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中EB染染色色法法高高2-5倍倍，，而而且且避避免免EB易退色的弱点。
易退色的弱点•用途：用途：PCR扩增指纹图、多重扩增指纹图、多重PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳酚保挟宙屠夕攀喻根工开弃驼遏隆缅婪隅愁返虏汐嚎划您就瘦绩砖桓专讳8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) •据据目目的的基基因因序序列列可可查查出出所所包包含含的的酶酶切切位位点点，，用用相相应应的的限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化PCR扩扩增增产产物物，，然然后后进进行行电电泳泳，，观观察察消消化化片片段段的的大大小小是是否否与与序序列资料相符列资料相符•用途：用途：–传染病病原体基因分型传染病病原体基因分型–人类基因的变异性研究人类基因的变异性研究牛蒲铰锌获征圃祸肚鞋隋磐碘绒漂六蜗那亩歧责阶缨丁进恭茂澎猫寇委萎8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 单链构型多态性分析法单链构型多态性分析法（（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP） •将将PCR 产物双链产物双链DNA（（dsDNA）变性为单链）变性为单链DNA （（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。
因此，电泳结束后，序列有关因此，电泳结束后，ssDNA带带位置的差异即可反映出位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异产物序列的差异坪奇殃税还殉阔酿粒毒免馆钩卡淫矾弟神萨舵局衔董抽腻遣棍沈镑密蕾祭8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 核酸探针杂交法核酸探针杂交法• 点杂交点杂交•反向点杂交反向点杂交•微孔板杂交微孔板杂交•荧光探针杂交法荧光探针杂交法馈定彬盔靴葛葵千刨架悦沦肘陨养卒吵扼萤痔沤股这酪每疮循甫胖蠢整初8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 点杂交（点杂交（dot blot））•原原理理：：将将扩扩增增产产物物变变性性后后直直接接点点在在尼尼龙龙膜膜或或硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，，再再用用放放射射性性或或非非放放射射性性标标记记物物标标记记的的寡寡核核苷苷酸酸探探针与之杂交。
针与之杂交•探针：探针：–放放射射性性同同位位素素标标记记探探针针检检测测的的敏敏感感、、特特异异，，具具有有不不稳稳定定性性和和放射性危害放射性危害–非非放放射射性性物物质质（（如如生生物物素素、、地地高高辛辛、、荧荧光光素素等等））标标记记的的探探针针稳定性高、使用安全、检测速度快稳定性高、使用安全、检测速度快•用途：主要用于用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析产物特异性鉴定及变异分析蔡尾袖端神弛担矢黄找扬喳转娇周淖咐客斩涕缔琵辟砸域灿罢驳烹糕筐摸8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 反向点杂交反向点杂交(reverse dot blot)•原原理理：：使使用用带带有有标标记记物物的的引引物物进进行行PCR扩扩增增，，然然后后将将扩扩增增产产物物变变性性将将不不同同的的寡寡核核酸酸探探针针固固定定在在尼尼龙龙膜膜上上，，用用变性的变性的PCR产物与之杂交产物与之杂交•探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。
探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件•用用途途：：反反向向点点杂杂交交特特别别适适用用于于遗遗传传性性疾疾病病多多个个位位点点的的点点突变分析突变分析•结果分析：结果分析：–正常纯合子正常纯合子–突变纯合子突变纯合子–杂合子杂合子窖快食讥税静践阅缝俩讫七喊债保拷队裳脯意啤茵肤再翌呢榔缆皱盼函稗8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 微孔板杂交微孔板杂交( microplate hybridization) 夹夹心心杂杂交交斥碴罗瓜沂嘱蚤芦弛片峻缘祖厌烈借故客簿简茅茧皱止聊烹背砖橡厢姓猜8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 荧光探针杂交法荧光探针杂交法•目前临床上常用荧光探针法来检测目前临床上常用荧光探针法来检测PCR产产物，主要的方法有物，主要的方法有TaqMan技术、分子信标技术、分子信标技术、复合探针法等。
技术、复合探针法等闯释峻标坚珊爽汗炎功仔胎陆说袍铲丙碎参铀借寐沏擂且曳件局泌哀碱横8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR产物测序产物测序 •对对PCR产产物物进进行行测测序序是是检检测测PCR产产物物特特异异性性最最可可靠靠的的方方法法，，可可将将PCR产产物物克克隆隆到到载载体体上上进进行行测测序序，，也也可可对对直直接接PCR产产物进行测序物进行测序惜瓣磺鼎斟胖翠履嚎撼秒予醇莆桥狼壮铂椰纪侍殊荫狗函国禹洱饭漱燕略8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 常见问题原因分析及处理常见问题原因分析及处理•假阳性假阳性 •非特异性非特异性PCR产物产物 •假阴性假阴性 •引物二聚体引物二聚体 该引什敞寝晃彻鞋婚喇想子侵稳周浴切厉傣惧涕耪官曲溜粤荐灼炯开肋贷8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 假阳性假阳性 • PCR产物是最主要的污染源。
产物是最主要的污染源•含有靶含有靶DNA序列的质粒的污染序列的质粒的污染•阳性对照的污染阳性对照的污染•标本之间的交叉污染标本之间的交叉污染•Taq聚合酶中带有细菌聚合酶中带有细菌DNA，当，当PCR扩增片段为保守的扩增片段为保守的rRNA序列时，易造成假阳性序列时，易造成假阳性 位载阴澳泪粒菏箭组赚陶诉凝祁母讥守宣獭秤言哲名恩智促塔撼欠丑奖野8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 怎么可能全家人都得了性病怎么可能全家人都得了性病 ???•何某，女，何某，女，46岁，某部队卫生所护士，离婚岁，某部队卫生所护士，离婚10年，与一男友交往年，与一男友交往5年她近来忽然感到阴部瘙痒，白带有异味，想到自己有非婚年她近来忽然感到阴部瘙痒，白带有异味，想到自己有非婚性行为，怕万一得性病被人知道，便悄悄到郊区一个小诊所去看性行为，怕万一得性病被人知道，便悄悄到郊区一个小诊所去看病结果被告知是病结果被告知是"淋病淋病"，用了许多药，未见明显好转。
她通过，用了许多药，未见明显好转她通过查书感到查书感到"问题严重问题严重”，担心全家都会传染，尤其是正读初中的，担心全家都会传染，尤其是正读初中的女儿被传染上怎么办？为了孩子，顾不上面子了她不仅带自己女儿被传染上怎么办？为了孩子，顾不上面子了她不仅带自己的女儿、的女儿、70岁老母到医院检查，还动员最近与其同居一处的妹妹、岁老母到医院检查，还动员最近与其同居一处的妹妹、妹夫及妹夫及14岁的外甥女都到医院检查医师给他们用最先进的岁的外甥女都到医院检查医师给他们用最先进的"PCR”检测，结果检测，结果6个人都是个人都是"淋球菌感染淋球菌感染”！！ 料够火紊峦安雏四莽融座芹什践赂妈俘井恨此璃想久搀埃骤俐盟在色蓬侄8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 非特异性非特异性PCR产物产物 •引引物物特特异异性性不不高高，，引引物物用用量量过过多多，，应应调调换换引引物物或或降降低低引引物物用量•Taq DNA聚聚合合酶酶质质量量不不好好或或用用量量偏偏高高，，应应降降低低酶酶量量或或使使用用质量较好的酶。
质量较好的酶 •Mg2+ 浓度过高，可适当调节浓度过高，可适当调节Mg2+浓度•退退火火温温度度过过低低，，退退火火及及延延伸伸时时间间偏偏长长，，可可提提高高退退火火温温度度，，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增进行扩增•热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数颗具陕积趟化去吩熊要点巨劫咎缘皋碎憨切慧诞佣酞窃惨层借边颁饯组残8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 假阴性假阴性 •引物设计是否合理引物设计是否合理 •标本中是否有标本中是否有Taq酶抑制剂，酶抑制剂，Taq酶是否失活酶是否失活•反反应应体体系系中中有有无无蛋蛋白白酶酶或或核核酸酸酶酶降降解解DNA聚聚合合酶酶或或模模板板DNA，，可在可在95℃以上加热以上加热10分钟使其灭活分钟使其灭活•反反应应体体系系中中是是否否有有较较难难去去除除的的蛋蛋白白质质抑抑制制PCR系系统统，，用用蛋蛋白白酶酶K重新处理常可获预期结果。
重新处理常可获预期结果•循循环环温温度度，，特特别别是是解解链链温温度度是是否否准准确确，，退退火火温温度度是是否否过过高高有有些些PCR仪仪指指示示温温度度与与实实际际温温度度不不符符，，过过高高则则酶酶在在前前几几个个循循环环中中迅迅速速失活，过低则模板变性不彻底失活，过低则模板变性不彻底•检测检测PCR产物方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳法敏感性较低产物方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳法敏感性较低•靶序列发生突变、缺失等靶序列发生突变、缺失等管埋烯战径铸循址憋琅迪进拓掺陡删衬爪射吸情京膝阳为隘肋剧加闯哀氮8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 引物二聚体引物二聚体 v两两个个相相同同的的或或不不同同的的引引物物分分子子之之间间有有较较多多的的碱碱基基配配对对，，特别是引物特别是引物3’端有互补区端有互补区v引物模板比例太高，可增加模板用量引物模板比例太高，可增加模板用量v退火温度过低退火温度过低v热循环次数过多。
热循环次数过多• 寝运吊冉呈心捣滇捅胆刮尤岸为钦昭筛铆蹬万免滁引颧渴琉咋耀挝流敌萄8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR污染及预防措施污染及预防措施 •分开操作区域分开操作区域•耐高压的试剂及器材应高温高压灭菌耐高压的试剂及器材应高温高压灭菌•使用一次性使用一次性Tip头、头、Eppendorf管等 •小量分装试剂小量分装试剂•样品制备应按无菌操作原则进行，避免样品间相互污染样品制备应按无菌操作原则进行，避免样品间相互污染•操作者带手套操作，且应勤换手套操作者带手套操作，且应勤换手套•使用尿嘧啶使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶控制糖基化酶控制PCR产物交叉污染产物交叉污染 •每次每次PCR操作都应设阳性及阴性对照操作都应设阳性及阴性对照 磕彩黎贮郊鹏盾忽皋青怖虞遏邀绿施夺宦躲撂隔谢磺饲十虚傻喀萌貉闸捏8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 RNA酶的污染与预防酶的污染与预防 •去除外源去除外源RNase污染污染–玻璃器皿常规洗净后，应用玻璃器皿常规洗净后，应用0.1% DEPC处理。
处理–所有溶液应加所有溶液应加DEPC至至0.05%~0.1%，室温处理过夜，，室温处理过夜，然后高压处理然后高压处理–操作者戴口罩和手套操作者戴口罩和手套–材料器材使用灭菌一次性用品材料器材使用灭菌一次性用品•抑制内源性抑制内源性RNase的活性的活性–使用低特异性使用低特异性RNase抑制物：如皂土、复抑制物：如皂土、复合硅酸盐、肝素、合硅酸盐、肝素、DEPC等–去除蛋白质物质：蛋白质变性剂、蛋白去除蛋白质物质：蛋白质变性剂、蛋白酶酶K、阴离子去污剂等，常与、阴离子去污剂等，常与RNA酶抑酶抑制物联合使用，以加强对制物联合使用，以加强对RNase活力的抑活力的抑制–RNase的特异性抑制剂：如的特异性抑制剂：如RNase阻抑蛋阻抑蛋白（白（RNasin）、氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物 饵兑斜壁咆采闸放炸趁刹栋泣嘘扼耽徐粳吗琅塑磐遣彩淆恍扭稽旋逐抗罗8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 PCR衍生技术衍生技术 •巢式巢式PCR（（nested PCR ）） •逆转录逆转录PCR（（reverse transcription-PCR，，RT-PCR）） •多重多重PCR(multiplex PCR) •重组重组PCR(recombinant PCR) •锚定锚定PCR（（anchored PCR, A-PCR）） •不对称不对称PCR（（asymmetric PCR）） •反向反向PCR（（inverse PCR）） •扩增长片段扩增长片段PCR（（long PCR，，long-distance PCR）） •免疫免疫PCR(immuno-PCR) •定量定量PCR 眉汪汀怕凉怯厉疲柔贪椽亲颗哭疹烃滓弥逛侥萤类每田匀凰显琅贪穆审磊8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 巢式巢式PCR（（nested PCR））咆起痢硝究孩琐揣擞陀暮甘丢舀庚廷遂掉务厉善程慌遂彩施刁澈揩死碘四8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 逆转录逆转录PCR（（reverse transcription-PCR，，RT-PCR） •逆转录酶逆转录酶•AMV逆转录酶（最适温度为逆转录酶（最适温度为42℃））•MoMLV逆转录酶（最适温度为逆转录酶（最适温度为37℃））•逆转录引物逆转录引物•随机引物；随机引物；•Oligo(dT)；；•特异性引物。
特异性引物•one-step RT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶、PCR引物、引物、dNTP和缓冲液，直和缓冲液，直接以接以mRNA 为模板进行逆转录和为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法扩增，称为一步法RT-PCR舍逛廖妨穗潭裁妈婴取雾趣谦惶庙笛撵挑骡斧叫埔涵墨蹈泛父燥渤纯锋殷8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 多重多重PCR(multiplex PCR) 纱谈韶槐行使邯嗡潜级润脊郁泻酋再舌缨篮略症零妻汽吝廷垒鸿蕴捐巍洒8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 重组重组PCR(recombinant PCR) 迁茸糕笨涕嘿临说捡仰饿服阔尔鱼销酪聪炳湾善驾哭浇委脉夺梧榆东浓痢8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 锚定锚定PCR（（anchored PCR, A-PCR）） •基本原理：抽提细胞总基本原理：抽提细胞总RNA或或mRNA，在逆转录酶，在逆转录酶作用下合成作用下合成cDNA，通过，通过DNA末端转移酶在末端转移酶在cDNA 3’端加上端加上poly(dG)尾。
据此设计锚定引物尾据此设计锚定引物poly(dC)，为，为提高扩增特异性，提高扩增特异性，poly(dC)在十二聚以上，锚定引物在十二聚以上，锚定引物5’端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信息根据已知的息根据已知的3’端序列设计基因特异性引物，与锚端序列设计基因特异性引物，与锚定引物一起进行定引物一起进行PCR扩增•用途：检测用途：检测T细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性谆孵贸肪传婚怯乳像风跪襄问绕衍吩纸狮律阎汁膝俐陈迸结俞维奶丹顷梦8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 不对称不对称PCR（（asymmetric PCR）） •基基本本原原理理：：采采用用两两条条不不同同浓浓度度的的引引物物，，即即非非限限制制引引物物(高高浓浓度度引引物物)与与限限制制性性引引物物(低低浓浓度度引引物物)，，二二者者之之比比为为50-100：：1。
在在PCR最最初初10-15个个循循环环中中，，扩扩增增产产物物主主要要是是双双链链DNA(dsDNA)；；第第15个个循循环环以以后后，，限限制制性性引引物物已已被被耗耗尽尽，，非非限限制制性性引引物物介介导导的的PCR就就会产生大量的单链会产生大量的单链DNA(ssDNA)•关键：控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比关键：控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例也有人先用等浓度的引物例也有人先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链扩增，制备双链DNA；然后以；然后以双链双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备单，制备单链链DNA 枣屑友剂臂汐虫缄靖臼恍屎庞掐浑直式颠逢滦除使赞遍德柿昆啡骋温站卜8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 反向反向PCR（（reverse PCR）） •反向反向PCR用于快速扩增已知序列以外的未知用于快速扩增已知序列以外的未知DNA片段，从而对未知序进行分析研究。
该法首先用片段，从而对未知序进行分析研究该法首先用已知序列和待扩增序列都没有切点的限制性核酸已知序列和待扩增序列都没有切点的限制性核酸内切酶将模板内切酶将模板DNA消化，再用连接酶使酶切产物消化，再用连接酶使酶切产物环化，使已知的和待扩增的未知序列都包含在环环化，使已知的和待扩增的未知序列都包含在环中在已知序列内设计一对反向的引物，即可扩中在已知序列内设计一对反向的引物，即可扩增已知序列以外的区域增已知序列以外的区域授玛绒亲向揪哑爵渺淫篡乌淬沁鲍畦杖燃饭段惟圃梭青恶耶芦搐佯术谗凄8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 反向反向PCR已知序列PCR用途用途：：未知序列的研究未知序列的研究限制酶切点（限制酶切点（X））限制酶切点（限制酶切点（X））限制酶限制酶X酶切酶切连接连接未知序列未知序列志茂诸忘鄙佰映掖穷腊墓怜旅销鞭马桩弟阮湿穗待眷转琐伸胀意依速标漳8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 扩增长片段扩增长片段PCR（（long PCR））•模板完整性：应用琼脂糖包埋细胞抽提法模板模板完整性：应用琼脂糖包埋细胞抽提法模板DNA 。
•引物：一般较长（引物：一般较长（22-35nt），），Tm值较大•DNA聚聚合合酶酶：：长长片片段段PCR应应采采用用错错配配率率低低的的耐耐热热DNA聚聚合合酶酶：：如如Ampli Taq、、rTth、、Hot Tube、、Vent、、Deen Vent、、Pfu、、rTma等Vent、、Deen Vent、、Pfu、、rTma等聚合酶有等聚合酶有3’-5’外切酶活性外切酶活性•PCR缓缓冲冲液液：：增增加加Tris的的浓浓度度或或改改用用Tricine缓缓冲冲液液以以增增强强缓缓冲冲能能力力，，并并使使缓缓冲冲液液pH适适度度升升高高此此外外，，加加入入适适量量的的甘甘油油、、DMSO（（二二甲甲亚亚砜砜））、、明明胶胶、、聚聚乙乙二二醇醇、、Tween 20等等物物质质，，有有助助于模板变性和维持于模板变性和维持DNA聚合酶的稳定聚合酶的稳定•热热循循环环：：增增加加延延伸伸时时间间（（一一般般1kb/min）），，提提高高退退火火温温度度，，同同时时采采用用热热启启动动热热循循环环后后期期，，适适当当增增加加延延伸伸时时间间，，以以保保证证产产物物充充分分延伸回咳惜朔擅叮驳苑钓陌骨活贾铝呛鲤捧憨寞莹钝莫诈踪丈委滥留徽吹嚷擅8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 免疫免疫PCR(immuno-PCR)歉锦系伙殿蝇舵惰捆遍嫁异恬倪锭矽啼婴彪梆碉挚做耻狰冤述谗吭拂誊失8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 原位原位PCR（（in situ PCR ）） •直直接接法法：：使使用用标标记记（（放放射射性性同同位位素素、、生生物物素素、、地地高高辛辛、、荧荧光光素素等等））的的引引物物或或脱脱氧氧三三磷磷酸酸核核苷苷酸酸（（如如dUTP））进进行行PCR扩扩增增，，则则标标记记物物掺掺入入到到PCR 产产物物中中。
最最后后用用放放射射自自显显影影、、免免疫疫组组化化或或荧荧光光法法检测检测 PCR 产物及其在细胞内位置产物及其在细胞内位置•间间接接法法：：先先进进行行细细胞胞内内DNA的的原原位位扩扩增增，，然然后后用用标标记记的的核核酸酸探探针针进行原位杂交进行原位杂交•原位逆转录原位逆转录PCR（（in situ reverse transciption PCR））阐浪椰腾辈晌淘戌误潭夺弘竖氏泉敌遏孩泡晤附参蛔割躺讹运悦僳霄碌谤8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 定量定量PCR •概念：概念：通过对通过对PCR终产物的分析或终产物的分析或PCR过程的监测，对过程的监测，对PCR起始模板进行定量起始模板进行定量的技术的技术 •N= N0(1+E)c 杯柬混脯臭梆申抹惋媳战倾瞩槛羊君猾怜呵坯梗亭璃亡翠盾令租炮雅眉环8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 定量定量PCR中扩增产物的检测方法中扩增产物的检测方法•凝胶电泳：凝胶电泳：•PCR-ELISA•荧光荧光PCR法法–由由于于荧荧光光PCR可可使使用用现现代代化化仪仪器器对对PCR产产物物实实行行实实时时检检测测，，很很容容易易保保证证扩扩增增在在指指数数增增长长期期内内进进行行，，是是定定量量PCR扩增产物检测的一个发展方向。
扩增产物检测的一个发展方向系欢吠透馈锯记晚钡禽蘸湿吧疙鼠准臭绎杏绝剁柒烂咆涤税苟有懦圭瑚怯8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 第二节第二节 荧光定量聚合酶链反应荧光定量聚合酶链反应（（Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction，，FQ-PCR）） •一、荧光定量一、荧光定量PCR技术基本原理技术基本原理•二、荧光定量二、荧光定量PCR技术技术•三、荧光定量三、荧光定量PCR测定的数据处理测定的数据处理•四、实时荧光定量四、实时荧光定量 PCR技术的应用技术的应用伤吞锦涡宫掳内借啡痪婶六欢渝瘤糯盔绅识查烤乓蔚篷逞夹坛圭办东埃簿8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 荧光定量荧光定量PCR技术基本原理技术基本原理•荧光扩增曲线图荧光扩增曲线图•Ct值值•标准定量曲线标准定量曲线 歉腺中滁疽钥谨阀耍慎扦帽缩羊产蚊狗招六幼亮恫击扩泉俐警淘乌鸳实云8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 荧光扩增荧光扩增曲线图曲线图•荧光定量荧光定量PCR：：通过对通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
随荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析随着着 PCR 反应的进行反应的进行,PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加每个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化比例增加每个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线.善革准遏醉叹纪饶蕾壶虱摆株学窗朽滁漱砒晕当恫石奉脓装是夹抠页漏戊8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 Ct 值值•N= N0(1+E) c•logN=logN0+clog(1+e) 惜蹲坪渍跳卤汉缕略两位巍当忙瑰沪稚划棺曝壬旨跨熙暇伯泵滦话缕削近8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 Ct值的重现性值的重现性•PCR循环在到达循环在到达Ct值所在的循环数时，刚值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
值是恒定的保沽雄淹岁贤诸枕牵纽奋班十腮蹭哎烂递燥左寡抿绅耪师仁其汕滓肃蚌利8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 捂操私予辟堰弹膘去弧醋免湾擅悼钥秤臭嚣衣娥利狱吼聂阐惹页姑寅恃茹8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 初始模板量的对数与初始模板量的对数与C(T)C(T)循环数之间循环数之间 呈线性关系呈线性关系标准定量曲线标准定量曲线荧光强度荧光强度---循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线诵瀑帛稗辐压兑虚码腋胡酸缩扇橱宿光耗肋下仪镶秦变譬抿拭络畜辕馁乒8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 荧光定量荧光定量PCR技术技术 •荧光染料法荧光染料法•荧光标记探针荧光标记探针– TaqMan荧光标记探针荧光标记探针– molecular Beacon荧光标记探针荧光标记探针– 荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针贡碧荷娟把匡丁穿喻隐理膀寡埔蛙押蜒虑普芦弯耶鬃庆物贺妥焉栋哥绎蹦8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 荧光染料法荧光染料法——SYBR染料染料•在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
产物的增加完全同步卧唱诌社掸酶泳予苗国砰专钠晤鳖缘黎梨呀代锣医侍适坍趋蛀摇掐亲皂探8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 SYBR-Green I5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission双链荧光染料双链荧光染料逗勋辕詹杉民葬昆途大哈禾悠佛逃陛终灯烧耪钙贿隆瞅朴邑田舶懊感拽漏8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 SYBR-Green I5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission柜月泞腊显署套尊季徊怂斋谬炕剑钱粘磊崇颊滇邪返律纠皋虾离噪以拳宴8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 溶解曲线分析溶解曲线分析（（TmTm））特异性问题诗稗柒趴络恒烛役砧析靖殴剩古戒辊讼卖萨骇贱谍籍媒毁歇铂叭擎紫颅足8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 TaqMan探针法探针法• 拿碧魁啊拟惹从忠砒虫辕言氓俭皱劝峙鸣储跃庆悄馁护纤仔备崖磐卓谁碴8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 •遵循一般引物设计原则；遵循一般引物设计原则；•引物之间的引物之间的Tm相差避免超过相差避免超过2℃；； •为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；两个外显子；TaqMan技术引物设计原则技术引物设计原则呈伶并烙瓣氮扑斌喂承唯典怒枯敝伤戊户墩族笔母虫烯莲侨痹薄间拂乳盟8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 TaqMan探针设计原则探针设计原则•先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针； •探针长度应在探针长度应在15-45bp（最好是（最好是20-30bp)，以保证结合特异性；，以保证结合特异性； •探针的探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构；折叠和二级结构；尽量避开二级结构； • Tm值在值在65-70℃，通常比引物，通常比引物Tm值高值高5-10℃，，GC含量在含量在40%－－70%；； •探针的探针的5’端应避免使用端应避免使用G鸟嘌呤鸟嘌呤——因为因为5‘G会有淬灭作用，而且即使是被切会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；割下来还会存在淬灭作用； 整条探针中，碱基整条探针中，碱基C的含量要明显高于的含量要明显高于G的含量的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； • 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针垛借饵坛痪陆乞入骄给壮来位退晶逗咋城浚运琅典插了称凭浦满画罪垢汛8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 TaqMan MGB 探针设计探针设计•尽量缩短尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于探针，但探针长度不少于13bp• 尽量避免出现重复的碱基，尤其是尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免碱基，应避免出现出现4个或个或4个以上的个以上的G重复出现重复出现 •原则上原则上MGB探针只要有一个碱基突变，探针只要有一个碱基突变，MGB探针探针就会检测到就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号生荧光信号)洞狙系烤胯呢测丹壹钧灭堂钱倒堡腐气乞诀黍案噪豺幼柞冰域叹摸咱抄涣8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 分子信标技术分子信标技术•工作原理工作原理–发夹形的寡聚核苷酸探针发夹形的寡聚核苷酸探针 –内部淬灭的荧光团内部淬灭的荧光团Loop 能和靶序列互补Stem 是由互补序列组成琶碑岛锁认指憎煎涸憨盎烩阜棵哎向子横彦铃憨寂蕴恐瞬居也礁忱蒸泳罩8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 RQExcitationRRExcitationEmission分子信标技术分子信标技术酞郝受佑从绪拄乡鸯隧朔诅埂认姓邀剁遂筏豫豁晾救怀疟暴痊犹赐崔迸驮8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640FRET ProbesExcitationEmissionTransfer荧光能量传递荧光能量传递恬蔚庚旗榆捏修理唐周溺渐掖虽愿磅初裳失子榷俘叁侍簿折联柄匿健伙虞8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 复合探针法复合探针法 盅孕杜险揍病砷栈披轧养竭羡私娱政薛高贱糊泡狮钙懂易稗葛眨陡逃宋识8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 其他核酸扩增技术其他核酸扩增技术•核酸序列依赖性扩增核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，，NASBA)•连接酶链反应连接酶链反应(ligase chain reaction，，LCR)•分枝分枝DNA信号放大系统信号放大系统 殖涉狈辱毒勉堤限库涵鞭已凰魏掸出溢氨犯彩简邵篆魄牛咐撵揪将临每扫8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 核酸序列依赖性扩增核酸序列依赖性扩增怪遗纶铆娠询案寞恿酮溢喀库薛刑贮怪咳槐著农酸植绩羌坍且肝冯卒稳讲8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 连接酶链反应连接酶链反应羽陨要毅侩崎测炒块滦晚裤锦剐烦冬窝鞋候肝痢戊炙廖剃峻诸璃碌锄衣牟8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 分枝分枝DNA信号放大系统信号放大系统缮坝欲昭琵叉沧王妈锨斜辐虫师瞎扫弥酚刘晴疡聋吴棒贸毛篇舅憨炉剪突8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 第四节第四节 临床基因扩增实验室的管理与质量控制临床基因扩增实验室的管理与质量控制 •一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置•二、操作人员培训二、操作人员培训•三、临床基因扩增检验实验室质量保证三、临床基因扩增检验实验室质量保证 融婿磅缔琅盎屏馏欧授计曼裔柞听浑皆君风怜都甫虫勘和楼逗降讹笨猿丈8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 临床基因扩增检验实验室的规范化设置临床基因扩增检验实验室的规范化设置吹闸咨穗闲粒非椰活朔亩颧腐崖态果娟阵信讽线哼呀辩主报尼贼球项瓤尺8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 操作人员培训操作人员培训•临床基因扩增检验实验室技术人员必须进临床基因扩增检验实验室技术人员必须进行上岗培训。
经过培训合格者，由培训单行上岗培训经过培训合格者，由培训单位颁发合格证书，并将培训合格人员名单位颁发合格证书，并将培训合格人员名单报卫生部临检中心备案获得培训合格证报卫生部临检中心备案获得培训合格证书者方可从事临床基因扩增检验工作书者方可从事临床基因扩增检验工作何是漫荐沈榴助滚穿侩嘲锣姚基敲诽秦懒邵稽乾螺攻暂甚桃占签炳牌棠己8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 临床基因扩增检验实验室质量保证临床基因扩增检验实验室质量保证 •标本的采集标本的采集•标本的预处理标本的预处理•标本的运送标本的运送•临床标本的接收临床标本的接收•核酸的提取核酸的提取•靶核酸的逆转录和扩增靶核酸的逆转录和扩增•污染与预防污染与预防•扩增产物的分析扩增产物的分析•质量控制质量控制–室内质量控制（室内质量控制（IQC））•标本制备标本制备•逆转录和扩增逆转录和扩增•板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控•测定结果的评价与报告测定结果的评价与报告–室间质量评价（室间质量评价（EQA））数荒捧何腥符天另弟坚蔬偶翱驾臭旱胁追斡村傻萄驰慷棋骇曹取慢镜勤厉8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 《分子生物学检验技术》《分子生物学检验技术》模块模块8· 核酸扩增技术核酸扩增技术 棘砌事沫办牛党痈簿谷锻谋抱召戮绳撰跨豢酋嫂炸画瑶救找隶匡瞧易丽蒜8核酸扩增技术8核酸扩增技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 。
