DNA酶切及凝胶电泳.docx

DNA 酶切及凝胶电泳第一节 概 述一. DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或 其附近的特异位点上，并切割双链DNA它可分为三类：I类和III类酶在同一蛋白质分 子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在I类酶结合于识别位点并随 机的切割识别位点不远处的DNA,而III类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物 上解离II类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的 核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列II类中的限制性内切 酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础绝大多数II类限制酶识 别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoR I识别六个核苷酸序 列:5'- GJAATTC-3'）,有少数酶识别更长的序列或简并序列II类酶切割位点在识别序 列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如Sma I :5'-CCCJGGG-3'）；有的 切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRl 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'...GJAATTC...3' —5'... G AATTC...3'3'...CTTAAfG ...5' —3'... CTTAA G...5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性 大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响当微量的污染物进入限制性内切 酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸 管头如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度若两者 可用同一缓冲液，则可同时水解若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必 须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解也可在第一个酶 切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙 醇，混匀后置-70°C低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶 切反应DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种 限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示在 DNA 序列分析、基因组的 功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱 都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立 在它的基础上。

构建 DNA 限制性内切酶图谱有许多方法通常结合使用多种限制性内切酶，通 过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各 种酶的酶切位点及其相对位置酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般 DNA 用量约为 0.5-lpg限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液 和最适反应温度(大多数为37°C)对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按 标准体系lyg DNA加1单位酶，消化1-2小时但要完全酶解则必须增加酶的用量， 一般增加 2-3 倍，甚至更多，反应时间也要适当延长二. 凝胶电泳琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化 DNA 片段的标准方法该技术 操作简便快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可 以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置此外，还可以 从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。

琼脂糖凝胶分离 DNA 片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段 琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳聚丙烯酰胺分离小片段 DNA(5-500bp)效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开聚丙烯 酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难聚丙 烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装 置进行DNA电泳琼脂糖主要在 DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的 浓度在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多 种因素决定:1、 DNA的分子大小：线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数 成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越 慢2、 琼脂糖浓度一个给定大小的线状 DNA 分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各 不相同DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系凝胶浓度的选择取决于 DNA分子的大小分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是121.5%,分离大 于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需 胶浓度为 0.8-1.0%。

3、 DNA分子的构象当 DNA 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还 和它本身构象有关相同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA 在琼脂糖凝胶中移 动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢如在电 泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起 还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一 种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同 一种 DNA4、 电源电压在低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比但是随着电场 强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大， 因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分 离范围将缩小要使大于 2kb 的 DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超 过 5v/cm5、 嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基 对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率 降低 15％6、 离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。

在没有离子存在 时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小,DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液 中（如误加10x电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或 DNA 变性对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE［含EDTA （pH8.0）和Tris- 乙酸］,TBE（Tris-硼酸和EDTA），TPE（Tris-磷酸和EDTA），一般配制成浓缩母液, 储于室温第二节 材料、设备及试剂、 材料九DNA:购买或自行提取纯化；重组pBS质料或pUC19质粒；EcoRI酶及其酶 切缓冲液：购买成品；Hindlll酶及其酶切缓冲液：购买成品;琼脂糖(Agarose):进口 或国产的电泳用琼脂糖均可二、 设备水平式电泳装置 ,电泳仪,台式高速离心机 , 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉 或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件三、 试剂1、 5xTBE电泳缓冲液：配方见第一章2、 6x电泳载样缓冲液：0.25%溴粉蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液，贮存于4°C3、 溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器,储于室 温即可第三节 操作步骤一、 DNA 酶切反应1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号，用微量移液枪分别加入 DNA 1腿和相应的限制性内切酶反应10x缓冲液2卩1，再加入重蒸水使总体积为 19卩1,将管内溶液混匀后加入1卩1酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离 心机甩一下,使溶液集中在管底。

此步操作是整个实验成败的关键 ,要防止错加， 漏加使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低2、 混匀反应体系后 ，将 eppendorf 管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板 上),37C水浴保温2-3小时，使酶切反应完全3、 每管加入2卩1 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用二、 DNA 分子量标准的制备采用EcoR I或Hindlll酶解所得的九DNA片段来作为电泳时的分子量标准九DNA为长度约50kb的双链DNA分子，其商品溶液浓度为0.5mg/ml，酶解反应操 作如上述Hindlll切割DNA后得到8个片段，长度分别为23.1，9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kbEcoRI切割1DNA后得到6个片段，长度 分别为21.2, 7.4, 5.& 5.6， 4.9 和 2.5kb三、 琼脂糖凝胶的制备1、 取5xTBE缓冲液20m 1加水至200ml,配制成0.5xTBE稀释缓冲液,待用2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5xTBE稀释缓冲 液,放入微波炉里（或电炉上）加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为 0.8％琼脂糖凝 胶液。

加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液加热时应盖 上封口膜,以减少水份蒸发3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏（宽约1cm）紧密封住将封好的胶 槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持 1mm 左右的间隙向冷却至50-60°C的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（EB）溶液使其终浓度 为0.5yg /ml（也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5yg/ml的EB溶液浸泡染 色）用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩 余的琼脂糖小心地倒入胶槽内 ，使胶液形成均匀的胶层倒胶时的温度不可太低 ， 否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡待胶完全凝固后拨出梳子 ， 注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5xTBE稀释缓冲液至液面恰好没过 胶板上表面因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以 要注意保证样品槽中应注满缓冲液4、 加样：取10卩1酶解液与2卩1 6x载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中若DNA 含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量每加 完一个样品要更换 tip 头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或 将样品槽底部凝胶刺穿。

5、 电泳：加完样后，合上电泳槽盖,立即接通电源控制电压保持在60-80V,电流在 40mA 以上当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约 2cm 时，停止电泳6、 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5yg/m1的EB溶液中，室温下染色20-25 分钟7、 观察和拍照：在波长为 254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有 EB 的电 泳胶板 DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带紫光灯下观察时应戴上 防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光 片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6，曝光时间 10-120秒（根据荧 光条带的深浅选择）8、 DNA 分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上，以样品槽为起点，用卡尺测量 九DNA的EcoR I和Hindlll酶切片段的迁移距离，以厘米为单位以核苷酸数的常 用对数为纵坐标，以迁移距离为横坐标，。