划痕及Transwell实验方法20130905.docx

划痕实验:1. 细胞接种到六孔板中，每孔接约5x105个细胞（SMMC7721，不同细胞 具体接种数量掌握为24 h能铺满板），放入37°C 5%CO2培养箱培养，2〜 24 h观察是否铺满板待铺满后开始划痕实验2. 用灭过菌的200uL黄色枪头在每个孔中间划一条痕（枪头垂直划线，每 次力度均一，划线要直，一次性划到底，可用板盖当尺子），PBS洗2遍， 去除划下的细胞，显微镜拍照（放大倍数为100倍）3. 换含不同药物的无血清培养液继续培养（空白组用PBS代替药物，每组 设3个平行）4. 24h或48h后拍照（放大倍数为100倍）固定点测量划痕距离是否改变5. 用Photoshop中的直方图测量间距大小，表示不同组细胞发生迁移的距 离将对照组迁移距离大小设为100%，实验组迁移比例为：（对照组迁 移距离-实验组迁移距离）/对照组迁移距离*100%6. 数据分析后作图O20£ S=a)opsw6 一50050O150Transwell 实验：1、 收取处于对数生长期的细胞终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍， 再用无血清培养基重悬，彻底去除血清干扰，调整细胞密度1〜5x105个2、 Transwell小室（孔径大小有不同规格，一般肿瘤细胞选8四m；迁移实验用 普通Transwell小室，侵袭实验用含有基质胶的Transwell小室）里加入制备 好的细胞悬液（1x105个），小室内液体总体积为200四L。

3、 24孔板中加入500应含10%胎牛血清的完全培养基将Transwell小室放 入24孔板中特别注意：下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的 趋化作用就减弱甚至消失了，因此在种板和培养过程中要特别留心，一旦出现气 泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板4、 将带有小室的24孔板置于37°C 5% CO2培养箱中培养，18-48 h后（时间依 不同实验不同细胞而定）取出，非贴壁细胞直接计数下层细胞数，贴壁细胞 拍照计数小室底部膜上细胞（步骤如下）5、 轻轻吸出小室内的培养基，用37C预热的PBS轻轻洗一遍，每孔加A4C预 冷的4%多聚甲醛（或甲醇）固定液500uL，于室温固定细胞20min，PBS轻 轻洗3次6、 用湿棉签轻轻刮出小室中上层细胞，重复3次7、 PBS轻轻洗3次，吸干残余PBS8、 每孔加入结晶紫 染色液400〜500uL（没过小室底部）于37 C中孵育30min9、 用枪吸出结晶紫并用双蒸水轻洗3次，室温倒置风干10、 显微镜拍照（200倍镜下每小室的一个横轴或纵轴拍五张图，计算平均细胞 数）数据分析后作图，比较不同药物对细胞迁移或侵袭速率的影响。

33%醋酸洗脱细胞，洗脱液570nm下测OD值T+DCT+ROHSCGA。