DNA的生物合成【生物化学与分子生物学精品】.pdf

生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学 第十四章第十四章 DNA的生物合成的生物合成 DNA Biosynthesis ( Replication ) 复制复制(replication) 是以是以DNA为模板的为模板的DNA 合成，是基因组的复制过程在这个过程中，合成，是基因组的复制过程在这个过程中， 亲代亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则作为合成模板，按照碱基配对原则 合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸 聚合反应聚合反应 复制复制 亲代亲代DNA 子代子代DNA 本章主要内容：本章主要内容： DNADNA复制的基本特征复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化 原核生物原核生物DNADNA复制过程复制过程 真核生物真核生物DNADNA生物合成过程生物合成过程 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 DNA复制的基本特征 Basic Rules of DNA Replication 第 一 节 半保留复制半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) DNA复制的主要特征复制的主要特征 一、一、 DNA以半保留方式进行复制以半保留方式进行复制 DNA生物合成时生物合成时，，母链母链DNA解开为两解开为两 股单链股单链，，各自作为模板各自作为模板(template)按碱基配按碱基配 对规律对规律，，合成与模板互补的子链合成与模板互补的子链。

子代细子代细 胞的胞的DNA，，一股单链从亲代完整地接受过一股单链从亲代完整地接受过 来来，，另一股单链则完全从新合成另一股单链则完全从新合成两个子两个子 细胞的细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一致碱基序列一致 这种复制方式称为这种复制方式称为半保留复制半保留复制 半保留复制半保留复制的概念的概念: : 子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式: : 全保留式全保留式半保留式半保留式混合式混合式 密度梯度实验密度梯度实验: : 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想 含含15N-DNA的细菌的细菌 培养于普培养于普 通培养液通培养液 第一代第一代 继续培养于继续培养于 普通培养液普通培养液 第二代第二代 梯度离心结果梯度离心结果 按半保留复制方式按半保留复制方式，，子代子代DNA与亲代与亲代DNA A 的的碱基序列一致碱基序列一致，，即子代保留了亲代的全部遗即子代保留了亲代的全部遗 传信息传信息，，体现了遗传的体现了遗传的保守性保守性 半保留复制的意义半保留复制的意义: : 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础， 但但不是绝对的不是绝对的。

A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C + 母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成 的复制叉的复制叉 子代子代DNA 二、二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制从起点向两个方向延伸 原核生物基因组是环状原核生物基因组是环状DNA，，只有一个只有一个复制起复制起 点点（（origin））复制从起点开始复制从起点开始，，向两个方向向两个方向 进行解链进行解链，，进行的是单点起始进行的是单点起始双向复制双向复制 复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象 A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter) ori ter A B C 真核生物每个染色体有多个起始点真核生物每个染色体有多个起始点，，是多复是多复 制子的复制制子的复制。

习惯上把两个相邻起始点之间习惯上把两个相邻起始点之间 的距离定为一个的距离定为一个复制子复制子(replicon) 复制子是复制子是 独立完成复制的功能单位独立完成复制的功能单位 5 3 oriorioriori 5 3 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 复制复制 3 三、三、DNA复制反应呈半不连续特征复制反应呈半不连续特征 3 5 3 5 解链方向解链方向 领头链领头链 (leading strand) 后随链后随链 (lagging strand) 顺着解链方向生成的子链顺着解链方向生成的子链，，复制是连续进行的复制是连续进行的 ，，这股链称为这股链称为领头链领头链(leading strand) 另一股链因为复制的方向与解链方向相反另一股链因为复制的方向与解链方向相反，，不不 能顺着解链方向连续延长能顺着解链方向连续延长，，这股不连续复制的这股不连续复制的 链称为链称为后随链后随链(lagging strand) 复制中的不连续复制中的不连续 片段称为片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment) 领头链连续复制而随从链不连续复制领头链连续复制而随从链不连续复制，，就是复就是复 制的半不连续性制的半不连续性。

DNA复制的酶学和拓扑学变化 第 二 节 The Enzymology and Topology of DNA Replication 参与参与DNA复制的物质复制的物质: 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP；； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶，， 简写为简写为 DNA-pol；； 模板模板(template): 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次 聚合；聚合； 其他的其他的酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子 (dNMP)n+ dNTP (dNMP)n+1+ PPi RNA引物引物 RNA引物引物 子代子代DNA 聚合反应的特点聚合反应的特点: : DNA 新链生成需新链生成需RNA引物引物和和模板模板；； 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行方向进行 一、一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合 全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：简称：DNA-pol 活性：活性： 1. 53 的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 A G C T T C A G G A T A3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性: ? 能切除突变的能切除突变的 DNA片段。

片段 能辨认错配的碱基对，并将其水解能辨认错配的碱基对，并将其水解 核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : （一）原核生物有（一）原核生物有3种种DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性 无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 20？？400分子数分子数/细胞细胞 多亚基不对称多亚基不对称 二聚体二聚体 ？？单肽链单肽链组成组成 250120109分子量分子量(kD) DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性 无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 20？？400分子数分子数/细胞细胞 多亚基不对称多亚基不对称 二聚体二聚体 ？？单肽链单肽链组成组成 250120109分子量分子量(kD) DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 个核心酶个核心酶 1个个 -复合物（复合物（ 、、 、、 、、 、、 、、 6种亚种亚 基）基） 1对对 -亚基（可滑动亚基（可滑动 的的DNA夹子）夹子） DNA聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构 全酶结构包括：全酶结构包括： 亚基亚基（（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亚基亚基具有具有35 外切酶活性（复制保真性外切酶活性（复制保真性 所必需）所必需） 亚基可增强其活性亚基可增强其活性 亚基亚基可能起组装作用可能起组装作用 核心酶由核心酶由 、、 和和 亚基组成：亚基组成： 两侧的两侧的 亚基发挥夹稳亚基发挥夹稳DNADNA模板链，并使酶沿模模板链，并使酶沿模 板滑动的作用板滑动的作用 2个个 -亚基亚基分别和分别和1个核心酶相互作用个核心酶相互作用，，其其 柔性连接区可以确保在复制叉柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的个全酶分子的 2个核心酶能够相对独立运动个核心酶能够相对独立运动，，分别负责合成分别负责合成 前导链和后随链前导链和后随链。

功能：功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶有促进全酶组装至模板上及增强核心酶 活性的作用活性的作用 -复合物由复合物由6种亚基组成：种亚基组成： 、、 、、 、、 、、 、、 功能：功能： DNA-pol （（109kD）） 对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复制和修复 中出现的空隙进行填补中出现的空隙进行填补 323个氨基酸个氨基酸 小片段小片段 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 N 端端 C 端端 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行 分子生物学研究中常用的工具酶分子生物学研究中常用的工具酶 DNA-pol （（120kD）） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活基因发生突变，细菌依然能存活 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生 损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。

因模板上，它也能催化核苷酸聚合因 此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复损伤的应急状态修复 （二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有聚合酶有5种种 DNA-pol 起始引发，有引物酶活性起始引发，有引物酶活性 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性 参与低保真度的复制参与低保真度的复制 在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用口的作用 粒体粒体DNA复制中起催化作用复制中起催化作用 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物和原核生物真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较聚合酶的比较 E.Coli真核细胞真核细胞功能功能 填补复制中的填补复制中的DNA空隙，空隙，DNA修。