2024届高三生物一轮复习课件《基因工程的基本工具和基本操作程序》.pptx

基因工程的操作工具及操作的基本程序基因工程的操作工具及操作的基本程序知识解读及实例分析知识解读及实例分析一、基因工程概念基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术基因工程(重组DNA技术/转基因技术)的概念理解操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切拼接导入表达原理基因重组结果创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品1、限制性内切核酸酶-“分子手术刀”（1）来源：主要来自原核生物（2）种类：数千种，限制酶不是一种酶，而是一类酶GAATTCCTTAAG（3）特点：能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，如下图二、基因工程操作的基本工具结果：产生黏性末端或平末端，如右图GAATTCCTTAAG作用部位：特定切点上的磷酸二酯键识别序列长度：大多数是6个核苷酸序列，如右图EcoEcoRR中轴线粘性末端平末端SamSam沿中轴线切开，产生平末端；沿中轴线两侧切开，产生粘性末端，如下图。

能被限制性酶特异性识别的切割位点一般都具有回文序列：即在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条反向读的碱基序列完全一致，如下图在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性核酸内切酶切割，会产生4个末端切割线性DNA一次产生两个DNA片段，但切割环状DNA一次只产生一个DNA片段，环状DNA变为线性DNA2、DNA链接酶-“分子缝合针”（1）作用：将双链 DNA双链片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶从大肠杆菌中分离得到只能链接互补黏性末端从T4噬菌体中分离得到黏性末端与平末端均可连接，但连接平末端的效率相对比较低2）种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶（3）作用部位：磷酸二酯键，且DNA连接酶没有识别特异性E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶（4）DNA连接酶与DNA聚合酶的区别与联系相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；DNA连接酶连接的是DNA片段名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链（5）几种相关酶的比较例析1.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（）注：Y为C或T，R为A或G。

A.Hind、Sma两种限制酶切割后形成平末端B.Sau3A限制酶的切割位点在识别序列的外部C.BamH和Sau3A两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHGGATCCKpnGGTACCEcoRCAATTCSau3AGATCHindGTYRACSmaCCCGGGC C点评：BamH和Sau3A两种限制酶切割后形成的黏性末端是不相同的例析2.第三代疫苗DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间限制性内切核酸酶的切点分别是Bgl、EcoR和Sau3A下列分析错误的是（）A.构建DNA疫苗时，可用Bgl和Sau3A切割目的基因和质粒B.图乙中只用EcoR切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团C.用EcoR切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶C C点评：用EcoR切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，会产生多种连接产物，有目的基因自连、质粒自连、目的基因与质粒正反向连接等。

3、基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”（1）作用：将目的基因转入受体细胞并在受体细胞内对目的基因进行大量复制能在受体细胞中稳定保存并复制有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞对受体细胞无害、易分离（2）运载体需具备的条件普通培养基不含抗生素选择培养基50g/ml四环素载体上标记基因的标记原理质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的3）种类：通常是用质粒，噬菌体、动植物病毒也可以三、DNA的粗提取与鉴定051、实验原理利用DNA、RNA、蛋白质和脂质在理化性质方面的差异进行提取和分离，DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2M的NaCl溶液中，DNA不溶于（冷）酒精，但某些蛋白质溶于酒精在一定的温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色研磨：10g香蕉果肉10mL研磨液，充分研磨过滤：双层尼龙纱布过滤离心：3000r/min离心2min，取上清液加冷酒精：入等体积冷酒精，静置35min，用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起丝状物。

研磨液成分作用SDS使蛋白质变性EDTA抑制DNA酶活性Tris-HCl缓冲液稳定DNANaCl溶解DNA2、实验步骤鉴定：丝状物或沉淀物二苯胺试剂2mL混匀，95沸水浴加热10min，冷却后观察到蓝色（二苯胺试剂2mL不加DNA做对照）从左至右：少量DNA、大量DNA、空白对照例析1.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（）A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C.预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNAD.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热A A点评：兔是哺乳动物，成熟的红细胞中无细胞核，提起不到DNA例析2.下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是()A.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后振荡,观察颜色变化B B点评：DNA在体积分数为95%酒精溶液中溶解度最低，可以析出DNA达到去除部分杂质提纯DNA的目的四、基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定1、目的基因的筛选与获取（1）目的基因筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

利用序列数据库和序列比对工具进行筛选2）获取目的基因方法：人工合成目的基因用PCR特异性地快速扩增目的基因 PCR是聚合酶链式反应的缩写根据DNA半保留复制的原理，在体外（PCR扩增仪）提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术3）利用PCR获取和扩增目的基因利用PCR获取和扩增目的基因时应具备以下条件:A、DNA的两条链需要解链、打开,用高温即可，两条链提供复制的模板B、需要四种脱氧核糖核酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，合成子链的原料C、需要耐高温DNA聚合酶，催化合成DNA子链D、需要两种引物，使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸DNA模板加热至90以上使双链分开冷却至50左右使引物与DNA结合引物DNA合成+DNA聚合酶+dATP +dGTP+dCTP +dTTP第一轮的产物变性90以上复性延伸冷却加热50左右引物模板结合72左右DNA从 5端 到3端延伸72时，PCR获取和扩增目的基因的过程变性复性延伸循环获取目的基因时至少要经过三次循环才能分离出目的基因，共消耗引物2n-2个 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。

PCR获取和扩增目的基因的鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来例析1.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示下列分析不正确的是（）A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基C.过程需要先加热至90以上后再冷却至50左右D.过程需要利用引物a和引物d获得突变产物ADD D点评：PCR扩增DNA的过程中，新合成的两条单链延伸方向相反，PCR1应选择引物a和b，PCR2应选择引物c和d，突变产物AD扩增选择的引物是a和d重叠延伸时，可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸，所以不需要引物，所以D错误例析2.为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（）A.B.C.D.B B点评：引物同向，另一端缺少引物，A错误；B、引物扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列，B正确；C、引物扩增的片段不含启动子，不含外源高效启动子片段，C错误；D、引物扩增的片段不含启动子，不含外源高效启动子片段，D错误。

例析3、根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段请从图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取 作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因的全序列信息B、C点评：右图中可知被插入的基因片段位置，再根据四种引物的延伸方向可推知，选用引物BC才能将被插入的基因片段扩增2、基因表达载体的构建(核心工作)游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因1）基因表达载体的作用 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用2）基因表达载体的组成（见右图）目的基因标记基因启动子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程终止子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录构建载体时，需要用同种限制酶切割载体和目的基因，以获得相同的黏性末端，便于两者顺利连接但是由于被切割后的质粒本身也具备相同的黏性末端，所以会有一定概率的自身环化，因此常用两种酶分别切割载体和目的基因（即双酶切），避免目的基因和质粒任意连接。

见下图(3)基因表达载体的构建过程3、将目的基因导入受体细胞（1）目的基因导入受体细胞 细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射法Ca2+处理法（感受态细胞法）受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程 以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取受精卵显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子 （2）农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上将花序直接浸没在含农杆菌的溶。