端粒相关蛋白在细胞衰老中的作用机制.docx

端粒相关蛋白在细胞衰老中的作用机制阐明端粒相关蛋白在细胞衰老中的作用，筛选出2-6 个参与调节 细胞衰老的关键“节点”基因明确端粒结合蛋白例如hnRNP Al等 3-4个端粒相关蛋白在细胞衰老信号网络中的作用揭示这些端粒相 关蛋白在细胞衰老中的作用机制研究方法及内容：（1）端粒结合蛋白hnRNP Al与细胞衰老中的作用:研究发现端 粒相关蛋白hnRNP Al可破坏端粒DNA的高级结构G-四联体，调节端 粒酶的活性，而且在体内端粒末端也检测到hnRNP Al的存在第一 课题组最近的研究也发现hnRNP Al蛋白和非编码RNA TERRA调节RPA 和POT1在端粒单链DNA上的转换，从而调节端粒长度及功能因此， hnRNP Al 在端粒调控中非常重要,可能与复制性衰老及肿瘤的发生、 发展密切相关ohnRNPAl的启动子区含有很多E-box,癌基因E2FAP1, AML和c-myc可以与之结合，而且这些癌基因在正常细胞里可条件性 表达所以,正常细胞的 hnRNP Al 表达在某些条件下可被癌基因调 控，向衰老或永生化方向发展①研究hnRNPAl蛋白差异表达机制， 阐明 hnRNP Al 蛋白在衰老过程中差异表达与细胞衰老主导基因的关 系及其 hnRNP Al 蛋白核浆穿梭的意义及其对端粒长度的影响。

进一 步研究hnRNP Al蛋白翻译后修饰及其对端粒G-四联体形成的影响 以及对端粒长度调节和相关疾病的诊断具有重要意义②研究hnRNP Al RNA降解机制在细胞衰老中的作用研究发现RNA结合蛋白hnRNP Al可影响pl6基因mRNA的稳定性，并且hnRNP Al表达减少伴随pl6 蛋白水平的显著增加我们拟深入研究hnRNP Al对细胞衰老与细胞 寿命的调节机制，了解hnRNP Al上游调节分子和其他靶标mRNA，以 及其它分子对此种调节作用的影响③研究hnRNP Al的转录调控 hnRNP Al 高表达,既可延缓细胞衰老,又有促癌作用,其表达调控 机制复杂多变研究如何保持其促癌作用与延缓衰老作用之间的平衡 是一重要问题环境与基因表达之间常常存在互动关系,我们将研究 hnRNP A1 的表达调控是否受环境变化调控2) 端粒酶TERT结合蛋白在细胞衰老中的作用:前期工作利用 酵母双杂交方法发现了多个新的TERT结合蛋白，并用GST沉淀和免 疫共沉淀等方法得到验证我们将进一步研究TERT结合蛋白的相互 作用如何调节端粒酶功能，以及对细胞周期、DNA损伤反应和细胞衰 老的作用机制①结合基因过表达和基因沉默研究TERT与其相关蛋 白的相互作用对细胞周期的调节作用。

将利用DNA损伤药物(HU, nocodazole, etoposide, cisplatin)诱导 DNA 损伤，分析 TERT 结 合蛋白之间的相互作用对 DNA 损伤修复、细胞周期检验点的调节作 用②基因沉默或过表达改变TERT结合蛋白和TERT表达水平后，通 过检测细胞增殖、细胞迁移、细胞集落形成等实验探讨TERT与TERT 结合蛋白相互作用的细胞生物学意义③我们前期工作发现TERT结 合蛋白例如C53在细胞复制性衰老中表达显著升高过表达或基因沉 默TERT结合蛋白基因后，观察细胞衰老进程，检测衰老基因表达(p53, p21, Rb, pl6)变化及端粒DNA损伤信号，明确TERT结合蛋白对细胞 复制性和过早性衰老的作用和机制3) TERT结合蛋白与成体干细胞衰老的关系：基于以上在体细 胞研究中的前期工作基础，进一步利用小鼠模型，在成体干细胞水平 研究TERT结合蛋白与端粒维持及细胞衰老的关系①在野生型小鼠 和端粒酶敲除小鼠中，观察成体干细胞(如骨髓造血干细胞)衰老过 程中 TERT 结合蛋白的表达变化，及其对端粒长度和端粒酶活性的影 响②分离和培养野生型小鼠和端粒酶敲除小鼠的骨髓造血干细胞， 在体外用过表达或基因沉默技术改变TERT结合蛋白的表达水平，分 析 TERT 结合蛋白的改变对成体干细胞增殖以及克隆形成能力的影 响。

③利用造血干细胞移植实验，探索TERT结合蛋白对年轻和年老 的小鼠造血干细胞自我更新能力和多系分化能力的影响通过移植 TERT 结合蛋白表达水平改变的成体干细胞到致死剂量照射的小鼠体 内，分析造血干细胞在体内的自我更新能力以及多系分化能力，并验 证 TERT 结合蛋白在骨髓造血干细胞增殖和分化过程中端粒维持中的 作用4）端粒相关蛋白TPP1、POTla、POTlb在成体干细胞稳态维持 和衰老中的作用：POT1 （在小鼠中分为POTla和POTlb）与端粒上的 单链DNA结合，起着保护端粒的作用POTla防止ATR激酶的激活， 从而抑制了端粒上的非同源末端连接（NHEJ）,而POTlb抑制5'端粒 DNA的切除两种POT1蛋白都可以与TPP1结合，形成异源二聚体与 其他的端粒蛋白相结合条件敲除TPP1后，导致POTla和POTlb从 端粒上解离在胚胎成纤维细胞中， TPPl 敲除的表型与 POTla 和 POTlb 双基因敲除的细胞表型类似，提示 TPPl 主要通过 POTla 和 POTlb起到保护细胞端粒的作用我们将利用TPPl、POTla和POTlb 基因敲除或者条件敲除小鼠模型，研究TPPl、POTla和POTlb蛋白在 小鼠成体干细胞稳态维持和衰老中的作用。

①利用TPPl、POTla和 POTlb基因纯合性缺失和杂合性缺失的小鼠模型，观察成体干细胞（如 骨髓造血干细胞）的衰老过程中端粒的结构和功能的维持②分离和 培养TPPl、POTla和POTlb基因纯合性缺失或者杂合性缺失小鼠的骨 髓造血干细胞，在体外通过克隆形成实验，研究TPPl、POTla和POTlb 基因对成体干细胞增殖和自我更新能力的影响③利用竞争性造血干 细胞移植实验，探索TPPl、POTla和POTlb蛋白对年轻和年老的小鼠 造血干细胞在体内重建造血和多系分化能力的影响通过连续移植实 验研究TPPl、POTla和POTlb基因纯合性缺失或者杂合性缺失对造血 干细胞在体内的长期自我更新能力以及多系分化能力的影响，并分析 这些蛋白是否与造血干细胞的自我更新能力和多系分化能力之间存 在剂量反应关系。