C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移的初步研究.pdf

南通大学硕士学位论文C胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移的初步研究姓名：高树梓申请学位级别：硕士专业：神经外科指导教师：高宜录;刘道坤20050501南通大学硕士研究生毕业论文英文缩略词表( 按字母顺序排列)英文缩写英文全称B D N FB r a i n - D e r i v e dN e u r o t r o p h i cF a c t o rb F G F 2B a s i cF i b r o b l a s tG r o w t hF a c t o r - 25 - B r d UB r o m o d e o x y u r i d i n eC Dc y t o s i n ed e a m i n a s eC N T FC i l i a r yN e u r o t r o p h i cF a c t o rC N SC e n t r a lN e r v o u sS t e mE T - 3e n d o t h e l i a l ．3G F A PG l i a lF i b r i l l a r yA c i d i cP r o t e i nG F P} 狂’L CI G F —Ig r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i nh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yi n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r - I ，M G Fm e l a n i ng r o w t hf a c t o rM G G Fm a s t e rc e l lg r o w t hg a c t o rN C A MN e u r a lC e l lA d h e s i o nM o l e c u l eN 0N P Cn i t r o g e nm o n o x i d eN e u r a lP r e c u r ，s o rC e l l中文全称脑源性神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子5 一溴脱氧尿苷嘧啶脱氨酶睫状神经营养因子中枢神经系统内皮素一3胶质原纤维酸性蛋白绿色荧光蛋白高效液相色谱法胰岛素样上皮因子黑色素生成素干细胞因子神经细胞黏附分子一氧化氮神经前体细胞南通人学硕士研究生毕业论文N S CP A G EN e u r a lS t e mC e l lP o l y a c r y l a m i d eG e lE l e c t r o p h o r e s i sP D G FP l a t e l e t ．D e r i v e dG r o w t hF a c t o rP N SP e r i p h e r a lN e r v o u sS y s t e mP S AS C FS ．] 旺{ A I LS V ZT G Fo 【V Zp o l y s i a l i ca c i ds t e mc e l lf a c t o rt u m o rn e c r o s i sf a c t o r - r e l a t e da p o p t o s i s —i n d u c i n gl i g a n dS u b v e n t r i c u l a rZ o n et r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o ro 【v e n t r i c u l a rZ o n e2神经干细胞聚丙烯酰胺凝胶电泳血小板源性生长因子周围神经系统多聚腺苷酸干细胞因子肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体室下带转化生长因子a脑室带塑望奎兰婴主竺茎兰兰些堡苎 C 。

胶质瘤细胞培养上清诱导神经千细胞迁移的初步研究研究生高树梓导师高宜录副教授刘道坤教授摘要背景及目的：已有研究发现神经干细胞移植至有移植胶质瘤生长的鼠脑内，神经干细胞很快充满肿瘤，并沿着浸润的肿瘤细胞分布并分化，即使将神经干细胞接种在肿瘤的远隔部位，甚至把神经干细胞接种在对侧的大脑半球和侧脑室，它们也能穿过正常脑组织移行入胶质瘤：甚至注射入静脉系统的神经干细胞都不同程度的聚集在胶质瘤内，而非注射局部这说明胶质瘤细胞中存在着诱导神经干细胞迁移和分化的信号物质，而且，在体内可以诱导神经干细胞向胶质瘤迁移那么，在体外培养的胶质瘤细胞是否也可以引起神经干细胞迁移昵? 如果能引起迁移，那么，可以推测在胶质瘤中，甚或在其培养上清中也存在着能促使神经干细胞迁移的因子，这将为研究吸引神经干细胞迁移的因子带来便利本研究的目的就是观察体外培养的胶质瘤细胞是否可以在体外引起神经干细胞的迁移，从而为研究胶质瘤细胞中存在促进神经干细胞的迁移的物质打下基础，并进一步分离、纯化该物质方法：从新生3 —5 天的s D 大鼠大脑皮层中分别培养神经干细胞和星形胶质细胞，从c 细胞株中培养出c 胶质瘤细胞将星形胶质细胞及c 。

胶质瘤细胞分别进行无血清培养约3 6 小时，各取处于指数生长期的C e 胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清4 0 01 1l 加入“T r a n s w e ll ”细胞培养室的下室，并加2 0 0u1 无血清培养基，培养室的上室中加入处于对数生长期的神经干细胞悬液2 0 0l al ，共培养3 6 小时，光镜下计数迁移的细胞数，经统计学处理，证实C 胶质瘤细胞的无血清培养上清有诱导神经干细胞迁移的作用，而培养的南通人学硕土研究生毕业论文星形胶质瘤的培养上清则无这种作用然后将c 胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清分别用微型浓缩器浓缩并将上述两种等浓度的浓缩上清蛋白加上样缓冲液煮沸离心后上样，行S D S ～聚丙烯酰胺凝胶电泳，转P V D F 膜，送蛋白质公司测序，从而初步确定这种能诱导神经干细胞迁移的信号物质为何物，为进一步分离、纯化该物质奠定基础结果：1 、原代神经细胞球免疫荧光检测呈N e s t i n 阳性，用B r d U 培养基传代培养的神经细胞球进行抗一B r d U 免疫荧光检测为阳性，说明培养获得的神经细胞球是神经干细胞球，并具有传代能力2 、对获得的胶质细胞进行抗胶质原纤维酸性蛋白( G F A P ) 免疫荧光染色呈阳性，表明培养的细胞是星形胶质细胞。

3 、c 胶质瘤细胞的培养上清引起神经干细胞迁移的数目明显多于星形胶质细胞的培养上清和新鲜无血清培养基方差分析和最小显著差数法统计结果显示在极显著水平上有差异( 组间和两两比较，p 瓶底面积的7 0 ％为准) 后，吸出旧培养液用C M F —H a n k s 液洗涤两次，加少许0 ．1 2 5 ％胰蛋白酶液消化5 - l O m i n ，至大部分细胞浮起( e L 时镜下可见许多星形胶质细胞收缩变圆突触消失) ，用含血清的培养液终止胰酶活性，吸管反复吹打使细胞从瓶壁上脱落，并将细胞悬液转移至容积为l O m l 的离心管，离心( 转速为t 0 0 0 r m p ) l O m i n ，弃上清液，给细胞沉淀物加新鲜培养液，制成细胞悬液后，接种在多个预涂有多聚赖氨酸包被的培养瓶中，再加入适量新鲜培养液，放入3 7 C 、5 ％C 0 培养箱培养，换液同前传代的星形胶质细胞用作无血清培养 5 ) 星形胶质细胞的鉴定—G F A P 免疫荧光检测①贴壁：按上述方法制成细胞悬液，接种至2 4 孔培养板内的盖玻片( 预先用多聚赖氨酸包被) 上，放入培养箱培养卜2 天，使细胞贴壁②固定：吸去培养液加入4 ％多聚甲醛l m l ，室温下固定3 0 m i n ，去除固定液，用0 ．0 1 MP B S 沈涤3 次，每次l O m i n 。

③封闭：用含1 0 ％羊血清、0 ．3 ％T r i t o n 一1 0 0 的0 ．0 1 MP B S 液在3 7 C 条件下孵育封闭l O m i n ④检测：吸去封闭液，加一抗( 小鼠抗G F A PI g G l ，按1 ：5 0 0 倍稀释) ，放入4 c 冰箱过夜，洗去一抗，用0 ．0 1 MP B S 洗涤三次，每次l O m i n 再加入二抗( F I T C 标记的羊抗小鼠I g G ，按1 ：2 0 0 倍稀释) ，避光，在3 7 C 水浴箱内孵育3 0 m i n ，吸去二抗，洗涤3 次，每次l O m i n 检测一抗、二抗均设阴性对照，下同) ⑤观察记录：在激发光波长为4 9 0 h m ，滤色光波长为5 2 0 h m 的共聚焦显微镜下观察照相 6 ) 星形胶质细胞的无血清培养待生长状态良好的星形胶质细胞长满瓶底后，将培养瓶中的上南遵大学硕士研究生毕业论文清弃去，用P B S 液轻轻冲洗三次后更换为无血清培养基( 仅含D M E M ／F ．的培养基) 继续培养3 6 小时2 ．c 胶质瘤细胞的培养与传代( 1 ) C 胶质瘤细胞的培养与传代C s 胶质瘤细胞株购自中科院上海细胞所，用含2 0 ％d 、牛血清的D M E M ／F 1 2 培养基培养4 —6 天，隔日换液一次。

待细胞生长处于对数期时分别接种在两个培养瓶中继续培养传代后的C 胶质瘤细胞用作无血清培养 2 ) C 胶质瘤细胞的无血清培养方法同星形胶质细胞的无血清培养3 ．神经干细胞的培养、传代与鉴定( 1 ) 取材选取新生3 —5 天的s D 大鼠，取材方法同星形胶质细胞 2 ) 细胞分离与接种在上述皮层组织中加入约6 - 8 m lD M E M ／F l 培养液并将其转移至l O m l 玻璃离心管，用吸管头光滑的毛细吸管轻轻吹打至皮层组织机械分离成单细胞悬液，用2 0 0 目筛网过滤后，离心( 转速为1 5 0 0 r ／m i n ) 5 m i n 后弃上清液，用含有b F G F ：／B 的D M E M ／F ，：培养基定容至4 m l 或8 m l ，细胞记数按2 5 a m 2 培养瓶中接种l x l 06 细胞／4 m l进行接种另外在2 5 c m 2 培养瓶中分别接种l x l 0 7 细胞／4 m l ，或l x l 0 5细胞／4 m l ，以观察接种细胞密度对其生长的影响 3 ) 原代培养将接种好的培养瓶放入3 7 c 、5 ％C 0 饱和湿度培养箱中培养约3 —4 天更换一次培养液。

第～次换液时，用毛细吸管轻轻将瓶中的培养液吸出一半，再加入等量的新鲜培养液，约5 —7 天原代神经细胞球形成 4 ) 传代培养将获得的原代神经球吹打制成单细胞悬液，接种至含B r d u ( 浓南通大学硕土研究生毕业论文度为5 L u n o l ／1 ) 的培养液中培养5 —7 天即可形成次代神经球3 —4 天换液 5 ) 神经干细胞鉴定～N e s ti n 免疫荧光检测①贴壁：将培养的原代神经细胞球吸出，接种至放在2 4 孔培养板内的盖玻片( 预先用多聚赖氨酸包被) 上，放入3 7 C 、5 ％C 0 培养箱培养2 小时，使神经细胞球贴壁②固定：同( 二) l 、( 5 ) ②③封闭：同( 二) 1 、( 5 ) ③④检测：加一抗( 小鼠抗N e s t i nI g G 按1 ：5 0 0 倍稀释) ，放入4 0 C 冰箱过夜，吸去一抗，用0 ．O l b tP B S 洗涤3 次，每次1 0 m i n 再加入二抗( F I T C 标记的羊抗小鼠I g G ，按1 ：1 5 0倍稀释) ，避光，在3 7 C 水浴箱内孵育3 0 m i n ，吸去二抗，用0 ．0 1 MP B S 沈涤3 次，每次l O m i n 。

⑤观察记录同前 6 ) 神经干细胞传代一吨r d u 免疫荧光检测①贴壁、②固定、③封闭：方法同神经干细胞鉴定④检测：加一抗( 小鼠抗B r d uI g G 按1 ：1 0 0 0 。