噬菌体的分离与纯化.docx

噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1. 菌种：大肠杆菌2. 试剂：氯仿3. 培养基：1） 液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g, NaCl lg,加 HO至 200mL, pH7.4,121 °C20min 高压灭菌;22） 3X牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g,牛肉膏0. 9g, NaCl 1・5g,加 HO至 100mL, pH7.4,121 C20min 高压灭菌；23） 固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1. 5g琼脂粉，121 C20min高压灭菌；4） 半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0. 7g琼脂粉，121°C20min高压灭菌4. 仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径0・22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水 浴锅,离心机等实验步骤1. 噬菌体的分离1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔 接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后 置37°C培养过夜/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗 下菌苔,制成菌悬液2）增殖培养：在盛有10mL 3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2） 大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL 混合后置37°C振荡培养12〜24h。

3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌 离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入 另一无菌离心管中4）确证试验 所得裂解液经37C培养过夜，经无菌检查没 有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几 滴氯仿，稍作混合，备用5 ）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0. 1mL（1 滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在 培养基表面上待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其 上，置37 C培养过夜如果滴有裂解液处形成无菌生长的 透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体2. 噬菌体的纯化（1）取上经证实的噬菌体裂解液0・1mL于一支无菌试管中，再加入0・1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀;（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45C （可预先溶化后置45〜55 C水浴锅内保温备用），加入0・2mL 上述噬菌体与细 菌的混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置 37C 培养 12~24h；3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）此过程制备的裂解液中往往有多种噬菌体，需进一步纯化；4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37C振荡培养，直至试管中菌悬液由浑浊变清；培养物经离心后取上清液，再重复步骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止注意事项1. 使用仪器要保证是灭菌的；2. 注意琼脂的浓度；3. 氯仿是易燃品，应远离火焰一、生物测定法1、双层琼脂平板法1）倒下层琼脂融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。

2） 倒上层琼脂融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50°C左右时，每 管中加入大肠杆菌菌液0・2mL,上述噬菌体增殖液0・2〜0・5mL，混 合后立即倒入上层平板铺平3） 恒温培养30C恒温培养6〜12h观察结果4） 观察结果如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑一 —噬菌斑2、 单层琼脂平板法省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至 2%，融化后冷 却至45°C左右，如同上法加入大肠杆菌和噬菌体增殖液，混合后迅 速倒平板30C恒温培养6〜16h后观察结果噬菌体效价的测定1、 倒平板将融化后冷却到45C左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于 11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在 培养皿底部注明噬菌体稀释度2、 稀释噬菌体按10倍稀释法，吸取0・5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有 4.5mL 1%蛋白胨水的试管中，即稀释到 10-1，依次稀释到 10-6稀释 度噬菌体与菌液混合将11 支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0・1mL于上述编号的无菌试管 中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0・1mL无菌 水，并分别于各管中加入0・2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液 与噬菌体液混合均匀，置37C水浴中保温5min，让噬菌体粒子充 分吸附并侵入菌体细胞。

接种上层平板将11支融化并保温于45°C的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养 基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀， 立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其 迅速地铺展表面水平静置，凝固后置37C培养观察并计数 观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30〜300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价计算公式：N=Y/V X X（N：效价值，Y：平均噬菌斑数/皿，V：取样量，X：稀 释度）例如：当稀释度为10-6时，取样量为0・1 mL/皿，同一稀释度中3 个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为:N = 186 / 0.1 X10-6 = 1.86X 109结果1、 噬菌体检查2） 绘出平板上的噬菌斑检测结果，指出噬菌斑和宿主细菌2、 噬菌体效价测定1）平板上噬菌斑数目噬菌体稀释度 10-4 10-5 10-6 对照噬菌斑数（个）/皿平均每皿噬菌斑数目2）计算噬菌体效价（即噬菌斑形成单位pfu, plague-forming unit）.■Dieci■黑MH； 空培养M人妙 字配J7tM#EWF幕好itwc。