光化学诱导树鼩脑血栓形成后海马BBB通透性及缺血微环境动态变化的研究.pdf

邪夕 L S硕 _1 学 使用荧光分光光度仪检测灌流液及血浆中 F I T C - D - 7 0 K 浓度，计 算 a C S F 经 B B B 对 F I T C - D - 7 0 K的单位血浆清除率( C l e a r a n c e r a t e o f F I T C - D - 7 0 K , C f ) ， 并 将 其 作为B B B 通 透 性 的 判断 指 标: 用高效液相色谱 ( h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y H P L C ) 技术检测灌流液中谷氨酸 ( g l u t a m a t e a c i d , G l u ) 和Y 一 氨基T酸 ( g a m m a - A m i n o b u t y r i ca c i d , G A B A )的含量;计算缺血后各时点的中风指数 ( s t r o k e i n d e x , S I )及星形胶质细胞活化指 数 ( a s t r o c y t e a c t i v i t y i n d e x , A A I ) ;利用电 子显微镜观察了缺血后 2 4 h患侧海马的形态变化。

结果:脑血栓形成后，缺血同侧海马 B B B通透性于缺血后4 h 开始升高，2 4 h 达到高 峰 ( 0 . 5 2 6 10 . 1 3 0 u 1 , P ( 0 . 0 1 ) ; 微环境内 G l u 含量在4 h 时显著降低 ( 1 . 7 2 士0 . 2 0 u m o l . U ， ，P 在突触传递过程中 发挥着重要作 用[26 1缺血后的G A B A变化，各家报道并不一致，大多研究显示，缺血后缺血区细胞外液中 G A B A含量升高，亦有研究显示缺血后 G A B A含量降 低[[2 71 本研究显示， 树韵皮层缺血后海马 微环境中G A B A含量在各时点均增加，以2 4 h 缺血侧增高最为明显缺血时微环境G A B A的增加与A S 的释放增加有关， 缺血时p H降低， 谷氨酸脱梭酶 ( G A D)活性增强，使 G l u转变为 G A B A增多;同时，G l u含量增多可激活G A B A能神经元细胞膜上的A M P A受体， 使G A B A能神经元释放G A B A增加12 81 目 前认为， G A B A具有神经 元保护作用， G A B A通过 G A B A A 受体抑制N O神 经 元 ， 进而 影 响C G M P 水 平 [2 8 1, G A B A 与G A B A A 受 体 ( G A B A A R ) 结合后，出现短暂的内向 C l ' 离子流，使细胞内C 1 旅 度上升，细胞膜出现超极化，细 胞 兴 奋 性降 低， 从 而 产 生 抑 制 效 应 [29 14 、中风指数与A S活化指数的病理生理意义兴奋毒指 数的概念由G l o b u s [3 01等于1 9 9 1 年提出， 用来描述氨基酸类神经递 质 的 量 及 其构 成， 其 计 算方 法为 : [ G l u ] x [ G ly ] / [G A B A ] , ( G ly :g ly c in e ， 甘 氨 酸) ，大量研究显示， 缺血后兴奋毒指数增高。

虽然亦有报道认为， 缺血后人脑组织各类氨基酸类递 质只是在总量上都增加， 并不出 现兴 奋性递质与抑制性递质的失 衡[3 11 ， 然而大多 研究认为， 缺血后兴奋性递质均增加，因 而这 就使以C N S中主要的 兴奋性氨基酸G lu 与主要抑制性氨基酸 G A B A的相互 变化关系作为评价缺血损 伤的 指 标 成 为 可 能 K u a n g 等 [3 21将 缺 血时 的G lu /G A B A比 值 称之 为 中 风 指 数( s tr o k e in d e x , S O ， 本研究 显示， 缺血后4 h ， 缺血侧海马S I 下降， 而在缺血后2 4 h 达到最高，缺血后 7 2 h , S I 仍处于较高水平，但较 2 4 h略有下降A S 的活化与缺血后神经元保护作 用有关， 根据本实验G lu 与G A B A变化的规律并结合本室以 往对A S 表达G F A P 的 研究以 及有关缺血后形态学变化的 研究报道， 我们提出星形胶质细胞活化指数 ( a st ro c y te a c tiv ity in d e x , A A I )的概念，A A I 为G A B A与G lu 的比 值， 我们认为这一比 值反映A S 的活化程度。

A S 是G l u 代谢的关键部位， A S 含有谷氨酞胺合成酶， 能将摄入的G in 转变为没有递质活 性的谷氨酸胺，并被安全释放入E C S ， 可被重新摄入神经元并脱氨基转变为 G l u ; A S还含有丙酮酸狡化酶和苹果酸酶，这两种酶分别涉及以葡萄糖为碳源合成G lu 和将过量的G lu 转化进入糖氧化途径的过程[3 3 1 ，因 而， A S 能将G lu 在物质 代谢与神经递质两种途径中 相互转化A S 也是兴 奋性递质 G lu 与抑制性递质G A B A代谢转化的 关键部 位， G lu 与G A B A的转化密切相关， 二者可以彼此相互转化 神经元内的 G lu在谷氨酸脱狡酶 ( G A D ) 的作用下转变为G A B A , G A B A由神经末梢释放后进入突触间隙，部分被A S 所摄取，在A S ,G A B A在 G A B A转氨酶 ( G A B A - T ) 的催化下脱氨基， 并转氨基给a 一 酮戊二酸，生 成G in , G in 在A S 所独有的谷氨酞胺合成酶的作 用下 加氨形成谷氨酞 胺( G in ) ，G i n由AS 释放进入 E C S再被神经元所摄取， 在神经元内作为合成 G l u 和 G A B A的 前体与原料 ( G in 脱氨转 变为G lu )-, A S 也可以 直接释放G A B A [“ 1 。

此外， 有易 臼差 兰老 牙 圣学述 之 i g ` 丈研究表明， 阻断A S 的G lu 代谢后， 神经元即失去 释放G l u 的 能力: 本研究也显示， G l u 与 G A B A含量的变化在统计学上具有相关性( 表 5 ) 因而， G l u 与 G A B A的代谢状态可以反映A S的功能活性，A A I 尚有待学者们进一步探讨本研究显示，缺血后 4 h ，缺血侧海马 A A I 达到最大，而在缺血后 2 4 h 达到最低， 缺血后7 2 h , A A I 仍处于较低水平， 而较2 4 h 略 有上升缺血初期同 侧海马A A I 上升与 缺血初期海马微环境中G lu 和K + 含量的 上升有 关，有证据表明，G lu 可以 通过 活化代谢型受体诱导A S 体积 增大[3 s] , E C S 中高K ` 与低渗透压也可以导致A S 的体积增大[[36 1，体积增大是A S 活 化的 特征之一 缺血后期，由 于微环境的损坏加重，A S功能受到抑制，因而 A S 活性降低5 , A S活化对缺血微环境的影响A S 的活化是指A S 在其受体激活时以及在应对细胞外微环境变化时所出现的机能、代谢及形态结构的 变化，表现为A S 的肥大和细胞的 增生 性改 变，即线粒体数目增多、 细胞中间丝蛋白等结构蛋白的表达增多， 并出现细胞受体及某些分子转运体功能的改 变等。

脑 缺血时，由 于能量代谢障碍而导致离子分布紊乱、 组织酸中毒并进一步导致神经递质的释放与摄取障碍， 在多种因素的作用下大量细胞因子产生，从而导致神经元微环境紊乱A S在 C N S中广泛充当了微环境损伤的微感受器， 离子紊乱， 大量兴奋性氨基酸的积聚以及多种前炎症细胞因子和化学因子的作用使A S 活 化. 任何病理过程都表现为机体的损伤与抗损伤的过程，A S 的 活化也是机体在应对脑缺血时 机体所产生的损伤与抗损伤反 应的一部分A S的体积膨大出现于缺血中心区的周围， 能改变 E C S的空间大小与几何形态， 使E C S体积的收缩、 E C S 的扭曲 度增加， 这种E S C的 体积与空间 变化可以减慢神经毒性物质在 E S C中的传导速度，限制梗塞区域微环境的恶劣变化向周围组织的扩散， 是 A S 的脑保护机制之一， 对于保持梗塞区外围环境的大致正常，维持神经元的正常活性具 有一定意义 然而， 这种早期的A S 的膨大是由 于细胞内N a + 、 水储留引起的， 也是 A S 代谢障碍的表现之一， 势必 会影响A S自 身和神经元的生存脑缺血后， A S的形态学变化除了 这种膨大外，还出现胞体的肥大，以 及突起的增生， 其显著标记是G F A P的 表达增多，A S 的 肥大改变了 脑组织的构 象， 有 利于神经元之间 形成新的 突触联系， 从而改变神经元的 功能， 以适应缺血带来的代谢改变。

研夕 L }X ' L学Z 'l蓉 C梗塞区周围 A S的另一个变化是增生性变化，表现为A S数目增多、线粒体数目的上升、线粒体靖增加、基质浓密，粗面内织网数目也增加，线粒体数 目的增加主要反映在核周区以及终足，这些变化反映了缺血后 A S 代谢的增强缺血后 A S的高代谢能最大满足其对 G l u 的摄取、自由基的清除、水的转运、细胞因子及 N O的生成等细胞主动代谢过程的能量需求， 对于维持神经元微环境的稳定有重要意义 脑缺血过程中大量 G l u 聚积干微环境内， 通过多种途径对神经元产生毒性作用， 活化的AS 通过加速对 G l u的摄取，可减少 G l u 在细胞外液中的蓄积; 活化的A S 在脑缺血时 能调节 细胞内外离子以 及酸碱平衡紊乱，由于能量代谢障 碍以及缺血区去极化导 致细 胞外K + 的蓄积， 细胞外的K 十 一方面使A S 离子载 体 活 化， 对K ' 的 摄 入加 强 ， 减 少 细 胞 外 液K + 的 浓 度， 能 保 持 神 经 元 的 正 常 活性; 另一方面， 细胞外高K 十 促进A S 去极化， 而A S 的去极化导致细胞内 碱性化，细胞外酸化，A S排出酸导致酸化的结果是神经元兴奋毒性的减低，对神经元起保护作用。

然而包绕于神经元外围的A S 网络对营养物质摄取的增加会减少 神经元的能量供应，在晚期，A S的 G l u T发生逆转，反而导致谷氨酸的释放，增加神经元的兴奋毒性 此外， 活化的A S 表 达多 种神经活性物质， 这些细胞因子种类繁多、功能复杂，有些对神经元起保护作用， 而有些 对神经元起损害作用A S 在脑缺血时 还能 释放还原型抗坏血酸和谷肤甘肤进入E C S ， 摄取两者的氧化形式，从而参与清除氧自由基三、脑缺血后B B B通透性变化的 机制B B B是C N S 保持神经元微环境性质稳定的 重要结构， 对于保持神经 元功能的正常发挥有着重要意义脑缺血时，B B B的破坏是神经元微环境紊乱、血管源性脑水肿的重要原因 我们研究显示，缺血后各时点海马 B B B 通透性均上升，尤以缺血后2 4 h 为甚，7 2 h略降:缺血后 2 4 h ，对侧海马 B B B 通透性也升高 、缺血后 日 日 B损伤的机制多 种原因导致B B B 的 破坏， 其表现为: ①构成B B B 细胞本身的 变性坏 死 脑缺血时， 由 于能量 代谢紊乱， 乳酸酸中毒等导致内 皮细胞以 及星形胶质细 胞的 坏死与凋亡， 从而使B B B 通透性增加; ②内皮细胞的吞噬泡明 显增多， 表明 物质通过这种转运方式跨B B B 转运增加; ③内皮细胞紧密联结蛋白 的表达减少以 及降解痊 夕 止 吃 生返 汐2 劳应讨戈增多; ④血管基质的降 解。

造成上述B B B 结构与机能损伤的原因 与下 列多 种介 质的 表达有关 ①基质金属蛋白 酶 ( M M P s ) : M。