细胞凋亡的几种检测方法.docx

细胞凋亡的几种检测方法1、 形态学观察方法(1) HE(苏木精一伊红染色法)染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞 表面有“出芽”现象2) 丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿 色荧光,胞质呈红色荧光凋亡细胞核染色质呈黄绿色 浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体3) 台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料 进入细胞,细胞变蓝,即为坏死如果细胞膜完整,细胞 不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞此方法对 反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助4) 透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染 色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞 器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体与凋亡小体被临 近巨噬细胞吞噬现象2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂,细胞内 小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少，胞质内出现 DNA片断但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在 核小体之间，出现180-200bpDNA片断，而坏死细胞 的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以 确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。

正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏 死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体核小体 由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检 测检测步骤1、 将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小 体;2、 在微定量板上吸附组蛋白体'3、 加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结 合合4、 加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体 上的DNA结合’4、加酶的底物,测光吸收制用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞可用于 人、大鼠、小鼠的凋亡检测该法不需要特殊仪器, 适合基层工作,但就是不能精确测定凋亡细胞发生的 绝多对量3、 流式细胞仪定量分析细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但就是其 程度介于正常细胞与坏死细胞之间利用这一特点, 被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量 细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞 核凋亡细胞应用价值流式细胞仪检测具有以下特点:1）、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状 态比较准确2）、可以做许多相关性分析3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的 细胞所处的细胞周期⑴检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法 细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度 介于正常细胞与坏死细胞之间,利用这一特点,被检测 细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬 液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞与凋亡 细胞。

利用Hoechs-P I染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧 光染色很浅，凋亡细胞主要摄取H oecha染料，呈现强蓝 色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红 色荧光2)DNA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术就是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(DUTP )与末端脱氧核苷 酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3・的羟基(- OH)端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术DNA片段原位标记法有二种：1、 原位缺口转移(in situ nick-translation,ISNT)技术， 它就是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂 DNA 的 3•- 0H 端2、 原位缺口末端标记技术(in situ end labelling technique,ISEL),即T UNEL法，它就是利用TdT将标记 的DUPT接到3・-O H端研究证明,TUNEL法的敏感性 远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合 适⑶检测细胞膜成分变化的Annexin V联合PI法 原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨 酸(PS)迁移至细胞膜外测。

磷脂结合蛋白V(Annexin V) 就是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度 的结合力因此,Annexin V可以作为探针检测暴露在 细胞外测的磷脂酰丝氨酸故利用对PS有高度亲与力 的Annexin V,将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸 荧光素FITC）,同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS 亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染 法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞结果判断:正常活细胞Annexin V、PI均低染;凋亡细 胞Annexin V高染、PI低染;坏死细胞Annexin V/PI均 高染应用价值:细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断 裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵 敏又 AnnexinV联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成 的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段 丢失因此,AnnexinV联合PI法更加省时,结果更为可靠，就是目前最为理 想的检测细胞凋亡的方法方法及步骤A、 直接标记抗体（FITC标记抗体）：（1）收集1x 106个细胞,800rpm离心5min,4C以上冷 PBS洗一次。

2)用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟,800rpm离心 5min去上清加2ml PBS重悬洗涤细胞,800rpm离心 5min⑶用1ml含5%人血清的PBS重悬细胞，冰上孵育 10min,800rp m离心5min去上清加入200ul含0、 5%BSA与饱与剂量的荧光标记抗体(5x105个细胞 /20ul抗体)的PBS，避光冰上放置30min,离心弃上清 加入200ul 1%多聚甲醛固定，待测即可4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细 胞B、 未标记抗体间接免疫荧光标记法:(1) 收集2x106个细胞，用冷的PBS 2ml洗涤细胞一次,800rp m 离心 5mino(2) 用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离 心 5min;2ml PBS 重悬细胞,800rp m 离心 5min;⑶用1ml含0、2%Triton-X100与5%血清的PBS重悬细 胞，冰上放置10min,800rpm离心5mino⑷加入饱与剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm 离心5min,用2ml冷的PBS重悬细胞,800rpm离心 5min,洗去未结合一抗，重复一次。

5) 加入荧光标记(FITC)标记的二抗,冰上避光放置 40min后,800rpm离心5min,去上清,PBS洗涤两次6) 加入0、5ml 1%多聚甲醛重悬细胞;固定待测7) 流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞C、细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品(PI染色) 的制备:(1) 待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃 上清2) 用4°C预冷的70%冷乙醇固定,4°C保存，至少固定 18小时3) 调整细胞浓度为106细胞/毫升,取1毫升细胞悬液, 用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中,37C孵育 30分钟即可进行流式分析⑷PI染液终浓度为50微克/毫升,RNase A终浓度为20 微克/毫升培养细胞染色体显示法(1) 传代培养细胞染色体显示法培养细胞—加秋水仙素—采集分裂细胞—离心—低渗 处理—预固定—固定—重复固定—制片—染色与封片 1.培养细胞:取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、 80%〜90%汇合单层培养细胞2•加秋水仙素:使用 最终浓度为0、02 ~0、8微克/毫升营养液，温箱继续培 养6-10小时；或用低温封闭法:把培养细胞置于4°C 条件下6-12小时后，再于37C温箱继续培养6〜10小时处理（加秋水仙素）。

3•采集分裂细胞:可利用分裂 中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,此时手持培养 瓶,左右反复横向水平摇动,令培养液在培养细胞表面 反复冲刷应用此法可使90％的中期分裂细胞从瓶壁 脱落,注意勿用力过猛,以防多量非分裂细胞脱落影响 观察4•离心:收集培养液,1000转/分钟离心5〜10 分钟5•低渗处理:吸除上清液、加入预温至37°C的 0、075M KCI溶液,在温箱中静置20〜30分钟6. 预固定:向悬液中加新鲜1：3醋酸、甲醇固定液1ml,用 吸管吹打调匀,此措施能起到先使细胞表面轻微固定, 可防止固定后细胞粘连成块7•固定:离心，同4,吸除 上清液，加新鲜固定剂5〜10ml;加固定剂时要用一手 微斜持离心管,另手用吸管吸取固定剂,把固定剂逐滴 滴在离心管壁上,使之慢慢流入离心管中,然后轻轻吹 打均匀，置15〜20分钟8•重复7,末次离心后，小心吸 除大部分上清,据悬液中细胞密度大小,余下固定液0、 5〜 1ml 9.制片:用滴片法制片,按如下步骤:彻底洗净载物片,勿留任何油脂,置冰箱中储备备用滴片前 现从冰箱中取出冷载物片1 片,在载物片表面出现细微 水气时,立即向片的一侧滴2〜 3滴细胞悬液,滴片时的 距离能保持半米高度才好。

滴片后置室温中令其自然 干燥,或用吹风机热风吹干亦可如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察10・染色与封片: —般常用Giemsa染色:取干液Giemsa 1份加pH6、8 磷酸缓冲液9份混合,染色10分钟后,水洗、晾干、可直 接观察如标本需要保存或做长时间观察,可过二甲苯 两次后,用中性树胶封片后,再过二甲苯,然后封片亦 可2）人末梢血微量全血培养染色体显示法1•培养 液准备:取15ml培养瓶数个，每瓶内分别充入5ml培养 液（pH 7、2）,内含:1640培养液（含10%〜15%小牛血 清）,PHA 0、1ml,青霉素100单位与链霉素100微克/毫 升培养液2•抽血针管准备:取2〜5ml针管一支，在 消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器, 无菌抽肝素（100 U/ml BBS）少许湿润针管，如动作迅 速不用肝素亦可3•采血:用棉签75%酒精给患者或 献血者的皮肤消毒两次，缚止血带，静脉取血1〜2ml 无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0、4〜0、5ml,如 系外出采血,安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌 条件略差的环境内操作,但动作要迅速,以减少污染;在 采血量不多或不应抽血的情况下,亦可在耳垂、手指肚 （无名指）用刺血针采血。

4•培养与加秋水仙素:37°C 温箱中培养到60〜 72小时之间,此时细胞分裂相最多, 向每培养瓶内加秋水仙素,最终浓度0、 02〜 0、 08微 克/毫升营养液,再培养4〜6小时 5.低渗:1000转/ 分钟离心10分钟,吸除上清液,加入预温过的0、075M KCI溶液10ml,置温箱中低渗处理15〜20分钟6•其 余步骤与处理传代细胞法相同3）羊水细胞培养1、 抽取羊水:无菌抽取羊水10-20ml,立即注入无菌离心 管2、离心分离:1000转份离心10分钟，弃去上清，留 0、5ml、3、培养:加培养液4ml（含小牛血清1ml）,用 NaHCO3调PH至6、8,置37度培养，在温箱培养7-10天, 可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长;加秋水仙素 0、 02-0、 8微克每毫升营养液,作用10-12小时 4、 其余步骤与传代细胞染色体制备方法相同一般染色 体制片程序1、 取对数生长期细胞一个T75或T25 瓶2、 将培养基换成10mlDMEM（H）+10%FBS+0、1ug/m l秋水仙素的培养基， 处理1~2小时 3、 将细胞培养液倒掉,马上加入3~4。