DH10B菌株感受态制备电击转化及转化效率检测.docx

大肠杆菌DH10B （Streptomycin resistan）电转化感受态制备1•从保存的甘油管中取出200 pL菌液到100 mL的LB液体中，370 200 rpm 培养约13~16 小时后（对数期），按2%接种到 SOB 培养基中；2. 37oC，约2〜2.5小时后，OD600约0.5左右，取出，冰上缓慢摇育30 min3．预先 4oC 降温的冷冻离心机离心收集菌体，用预冷的离心管，并时刻保持在 冰上， 5000 rpm 离心 5 min；4. 用 50〜60 mL 的冰预冷灭菌超纯水洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并 时刻保持在冰上，第二次洗时可以将 2 管的菌体并到一管，水洗过程离心的 转速要高一些，约6000 rpm离心5 min,因为离心得不是很实，离心完后要 立即倒掉上清，以免菌体重新悬浮造成损失；5. 用50 mL的冰预冷灭菌10%甘油洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时 刻保持在冰上，离心后立即倒掉上清；6•最后一次甘油洗涤后立即倒掉上清，视菌体量加入0〜x卩L的10%冰预冷甘油 重新悬浮细胞，75~200卩L/管,分装到预冷的离心管中，电转化或立即放入 -80oC冰箱保存，该感受态可以在-80oC保存半年。

SOB培养基（1L）：20 g Tryptone；5 g Yeast Extract；0.6 g NaCl；0. 19 g KCl， 8 磅灭菌 20 min注意事项：＞种子一定要新鲜，最好是从甘油管中直接液体活化的＞ OD60o控制在0.5左右，建库用的话千万不要过！过了 0.6感受态效率不会太 高，做一般克隆和质粒转化的要求可以适当放低＞ 菌体时刻保持冰上（4 oC以下）！尽量减少离开冰的时间＞最后分装的菌体浓度要浓＞对待菌体要尽量轻柔＞收集菌体用的管和枪头要灭菌，并在超净台操作电击转化1. 75 pL的感受态细胞加入TE溶解的质粒和连接产物最好不要超过0.6卩L，不 然容易击穿，如果质粒是用纯水溶解的可以适当提高，冰上放置 10〜30 min；2. 洗干净并烘干的电转杯冰上预冷，快速将上述感受态细胞转到电转杯里，感 受态细胞要位于杯子底部；3. 此步骤动作要快：将杯子外壁擦干，2 mm的杯子用电转化程序Ec2， 1 mm 杯子用电转化程序Ec1，电击后立即加入900~1000 pL37oC预热的SOC （见分子 克隆），轻柔吸打，转到2 mL的离心管中，37oC摇床，150 rpm， 45~60 min后 取适量涂平板。

感受态细胞转化效率检测1. 取已知浓度的pUC19质粒（例如0.1 ng/pL） 0.2 pL到制备好的75 pL感受态 细胞中，按上述方法转化；2. 转化后取1 pL涂氨苄LB平板，37oC过夜；3. 数平板上的菌落数，转化效率为每微克DNA (即质粒)转化所长出的单菌落 数，即cfu/pg举例说明：平板上长出750个单菌落，则转化效率=750 cfu 三[(0.2 pLXO.l ng/pL)三1000]=3.75 X 1010 cfu/pg建库用的感受态效率要大于108 cfu/p g DNA。