酵母表达体系.docx

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将 甲醇氧化为甲醛和过氧化氢为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧 化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分由于醇氧化酶与02 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶而调控产生醇氧化物 酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2细胞中大多数的醇氧化酶 是AOX1基因产物甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，为Mut+ 菌株，可占可溶性蛋白的30%以上°AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性， 但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇 利用缓慢表型可分离 Muts 菌株毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达利用含有a因子序列的分 泌型载体即可翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型, 毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖 残基）比酿酒酵母中的（50-150个甘露糖残基）短得多菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71 （Muts）分泌型载体:pPICZa A,B,and C（5'AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，a分泌信号介导的分泌表达, Zeoci n抗性基因，C端含有6XHis标签） 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，一：分子克隆1. 设计引物分泌型载体图谱见酵母表达说明书(p13-pPICZ A, p14-pPICZ B,p15-pPICZ C)扩增基因预变性变性98°C 2min98°C 10sec退火56°C 10sec延伸72°C 30sec完全延伸72°C 10min保存4°C30个循环PCR反应体系（50|1丨）模板DNA1 |i 1Forward Primer (10 ^M)1 |i 1Reverse Primer (10 ^M)1 |i 1dNTP Mixture(各 2mM):4|! 15XPrimerSTAR buffer (Mg2+ plus)10|! 1PrimerSTAR DNA PolymeraseU 1ddH2Oup to 50 u 1PCR 反应流程3.双酶切及其回收双酶切反应体系（40|11）DNA（空载体或目的基因）30 u 1BamHIu1Xho1Iu110XBuffer KU 14.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离，并通过胶回 收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸 取目的基因和空载体的总体积为5^1,在加入等量的5^l DNA快速连接试剂盒 Solution I, 16°C 连接 4-6h。

转化到克隆型感受态（DH5a和TopIO），使用低盐LB培养基，加入25 ng/mlZeoci n,双酶切法鉴定重组质粒后，送测序双酶切鉴定体系（10|!丨）DNA（空载体或目的基因）6|! lBamH 1U lXhollU l10XBuffer KU l二：线性化重组质粒1. 提取重组质粒20ml低盐LB培养基（25 |ig/ml Zeoci n）,提取150u丨重组质粒2.重组质粒线性化体系：重组质粒线性化体系（80U l )重组质粒70 u lSac1/Pme 12UlBuffer8 u l37°C水浴酶切过夜（约12-24小时）,取酶切后质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 可冻存在-20°C3. 线性化产物的浓缩（若回收的线性化质粒浓度大于100ng/ul,则不需要浓缩，50ml酵母培养液 得到200ul感受态细胞，使用10ul线性化质粒+100ul感受态进行电转）（1） 65°C, 20mi n灭活限制性内切酶（2） 加入等体积（酚：氯仿：异戊醇=25:24:1），振荡均匀，RT,12000rpm, 离心1mi n,取上清3） 加入等体积氯仿，振荡均匀，RT, 12000rpm，离心1mi n,取上清。

4）加入 倍体积醋酸钠（pH二，3M） ,2倍体积预冷无水乙醇，振荡均匀，-80°C,放置30min 后，4°C, 12000rpm,离心40min.（5）将沉淀用70%乙醇500ul,洗两次，14000rpm,4°C，离心10min,晾干后，加 入10ulddH20溶解即可，-20°C保存三：酵母电转化感受态细胞的制备1活化酵母菌：取出存于-20°C冰箱的GS115无抗YPD平板，挑取单克隆，划线 于新的无抗YPD平板上，30°C烘箱培养16h2挑取酵母单菌落，接种到50ml无抗YPD液体培养基，250rpm, 30°C培养15h3取50,菌液接种于100ml培养基中，250rpm，培养至0D值在~之间4分装菌液至灭菌的50ml离心管，4°C，3700rpm，离心10min5弃上清，加50ml预冷至4°C的无菌水，重悬细胞，剧烈震荡200次，4°C, 3700rpm，离心1mi n，重复用无菌水洗一次6弃上清，用2ml 1M山梨醇（1M）清洗沉淀后，加入400ul 1M山梨醇重悬四：电转化至酵母感受态细胞中1取5J线性化回收产物，加入至100,新鲜制备的电转化感受态细胞中， 混匀移入干净的EP管中（避免气泡出现）。

2取预冷于-20°C的电极杯，放在冰上设置电转化参数：电压1200V，时间5ms3将重组质粒与感受态细胞混均匀后，加入到电极杯中，等待1-2min（使细 胞DNA体系与电极杯能充分接触，利于电转的成功）4立即向电转杯中加入1ml山梨醇，用移液枪充分混匀从电转杯中吸出液 体，加入到灭菌EP管中30°C烘箱1h（1-2）复苏5取出复苏的菌液，4000rpm，离心5分钟，弃掉800 ^丨上清将剩余的 300 J细胞重悬，涂含有25^g/ml Zeoci n抗性的YPDS平板上，30°C培养箱 避光，倒置培养3天五：（可省略直接进行小试）菌落PCR鉴定待YPDS的Zeoci nTM平板上长出单克隆后，挑取单克隆，接种于YPD液体培 养基中，加25 ^g/ml Zeoci nTM抗生素避光培养，转速250rpm，30°C培养16 小时酵母菌落PCR鉴定体系如下：PCR鉴定反应体系（50|il）菌液U lForward Primer (10 ^M)1 U lReverse Primer (10 ^M)1UldNTP Mixture(各 2mM): 10XEasy Tag buffer (Mg2+ plus) Easy Tag DNA Polymerase4|! l5 |d lU l up to 50 U lddH02PCR反应程序设定：PCR鉴定反应流程预变性95°C 5mi n变性95°C 60sec~^退火54°C 60sec45个循环延伸72°C 90sec 亠再延伸72°C 10min保存4°C1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

六：小试1. 挑取隆菌落，接种到5ml YPD培养基，28-30°C培养过夜，全部转入20-50ml BMGY中，28-30°C培养至0D600=2-6, 4000rpm离心10mi n,弃上清，将菌体 转入50T00ml BMMY中，加入1%甲醇诱导表达2. 若蛋白小于10kDa，分别12, 24h取样，SDS-PAGE检测；一般情况，12, 24, 36h分别取样，SDS-PAGE检测表达情况七：重组蛋白的表达1、 挑取酵母阳性单克隆菌落，接种于5ml YPD中，28-30°C培养过夜全部转 入100ml BMGY培养基中，加抗生素ZeocinTM至浓度2ul/ml,250rpm，28-30°C摇 床培养16-18h用紫外分光光度计测0D值为2-62、 将培养的酵母菌取出，分装至50ml离心管中，4000rpm, 4°C,离心10分 钟，弃上清，向沉淀中加入20-30ml的BMMY培养基重悬酵母菌3、 将菌液倒入400ml培养基的2L锥形瓶中，每瓶加入2ml（体积分数为%）的甲 醇，250rpm, 30°C培养，诱导蛋白表达4、 每隔24小时，向瓶中加入4ml甲醇诱导（体积分数为1%），诱导96小时 左右。

5、收菌：取出培养瓶，4500rpm,离心30分钟，取上清，倒入50ml高速离心 管中，14000rpm，离心 40min.弃沉淀物，取上清或者破菌，进行纯化配制溶液Salt LB Medium with Zeocin?10 g Tryptone5 g NaCl5 g Yeast Extract1. Combine the dry reagents above and add deionized, disti l l ed water to950 ml. Adjust pH to with 1N NaOH. Bring the volume up to 1 liter. For plates, add 15 g/L agar before autoclaving.2. Autoclave on liquid cycle at 15 psi and 121°C for 20 minutes.3. A l l ow the medium to coo l to at l east 55°C before adding the Zeocin? to 25 ug/ml final concentration.Storeplatesat4°Cinthedark.PlatescontainingZeocin?arestable for up to 2 weeks.2. YPD (+ Zeocin?) Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 liter) 1% yeast extract2% peptone2% dextrose (glucose)+ 2% agar+ appropriate concentration of Zeocin?1. Dissolve: 10 g yeast extract 20 g of peptone in 900 ml of water.2. Include 20 g of agar if making YPD slants or plates.3. Autoclave for 20 minutes on liquid cycle.4. Add 100 ml of 20% dextrose (filter-sterilize dextrose before use).5. Cool solution to ~60°C and add the appropriate amount of Zeocin? from a 100 mg/ml stock solution.Note: It is necessary to include Zeocin? in the medium for selection of Pichia transformants only. Zeocin? may be omitted from the medium when performing e。