分子发光分析法.docx

分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分 子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光 (Molecular Luminescence)依据激发的模式不同，分子发光分 为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等光致发光按 激发态的类型又可分为荧光和磷光两种本章讨论分子荧光 (Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence) 和化学发光(Chemiluminescence)分析法第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以 荧光强度进行定量的一种分析方法早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质 时这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停 止时，物质的发光也随之很快消失到1852年才由斯托克斯 (Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子 荧光斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基 础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段1867年Goppelsroder应用铝一桑色素络合物的荧光对铝进行了测定进 入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术 得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。

荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分 光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好虽然能 产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光 度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具 有荧光性质使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、 痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义二、基本原理(一) 分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子根据保里不相容原理，基态分 子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多 数基态分子处于单重态(25+1=1)，基态单重态以S0表示当物 质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处 于第一、第二电子激发单重态，以S］、S2表示处于电子激发 态的分子是不稳定的，它会很快地通过无辐射跃迁和辐射跃迁 释放能量而返回基态辐射跃迁发生光子的发射，产生分子荧 光和分子磷光；无辐射跃迁则以热的形式释放能量，包括振动 弛豫(VR)、内转化(ic)和体系间窜跃(isc)等图5-1为分子内所 发生的各种光物理过程的示意图图5-01分子内的光物理过程.doc图5-01分子内的光物理过程.JPG图5-1分子内的光物理过程A],A2-吸收F-荧光P-磷光ic-内转化isc-体系间窜跃 VR-振动弛豫振动弛豫是在同一电子能级中，分子由较高振动能级向该 电子态的最低振动能级的非辐射跃迁。

振动弛豫过程的速率极 大，在10-14〜10-12s内即可完成内转化是相同多重态的两个电子态之间(如Sys1,s1-s0) 的非辐射跃迁内转化过程的速率在很大程度上决定于相关能 级之间的能量差相邻单重激发态之间能级较近，其振动能级 常发生重叠，内转化很快因此，通常不论分子被激发到哪一 个电子激发态，在10-13〜10-Us内经内转化和振动弛豫都会跃迁 到最低电子激发态的最低振动能级上基态(S0)和第一电子激发 单重态(SJ之间的能量差较大，因而S]-S0内转化的速率相对要 小得多，使得第一电子激发态有相对较长的寿命处于第一电子激发单重态最低振动能级的分子，以辐射跃 迁的形式返回基态各振动能级时，就产生了分子荧光由于激 发态中存在有振动弛豫和内转化现象使得荧光的光子能量比 其分子受激发所吸收的光子能量低因此，荧光波长4总比激 发波长气或、要长而且，不论电子开始被激发至哪个能级， 都将只发射波长为X3的荧光荧光的产生在10-9〜10-6S内完成体系间窜跃是指不同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁当分子的第一、二电子处于激发三重态（2S+1=3）时，以T「 T2表示单重激发态S］的最低振动能级同三重态T］的较高振动 能级重叠。

因而句…孔的体系间窜跃就有了较大的可能性第 一电子激发单重态的分子经体系间窜跃到达三重态后，快速振 动弛豫至最低振动能级v=0上此时有两种途径返回基态，一 是辐射跃迁发出磷光，二是体系间窜跃由于改变电子自旋的 跃迁属禁阻跃迁，因而跃迁速率小得多，使得三重态有较长的 寿命，约为10-3〜10 s（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率 物质在吸收了紫外和可见光后，激发态分子 是以辐射跃迁还是以非辐射跃迁回到基态，决定了物质是否能 发荧光通常以荧光效率（或荧光量子产率）来描述辐射跃迁概率 的大小荧光效率定义为发荧光的分子数目与激发态分子总数 的比值，即荧光效率《)=发荧光的分子数 (5—1)f激发态分子总数荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质发射的荧光也 就越强，若以各种跃迁的速率常数来表示，则中=—K— (5—2)f i式中：Kf为荧光发射过程的速率常数，2、为非辐射跃迁 的速率常数之和一般来说，Kf主要取决于物质的化学结构 而2K.则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关具有 分析应用价值的荧光化合物，其荧光效率在0.1〜1之间2.荧光与分子结构的关系 首先，物质只有能够吸收紫外 一可见光。

才有可能发荧光因此，发荧光的物质分子中必须 含有共轭双键这样的强吸收基团，且共轭体系越大，n电子的 离域性越强，越易被激发而产生荧光大部分能发荧光的物质 都含有一个以上的芳环，随共轭芳环增大，荧光效率提高，荧 光峰向长波校方向移动如萘的荧光效率为0.29，荧光波长为 310 nm，而蒽的荧光效率为0.46，荧光波长为400 nm其次，分子的刚性平面结构有利于荧光的产生以荧光黄 和酚酞为例，二者结构十分相似，但荧光黄在0.1mol-L-1NaOH 溶液中的荧光效率高达0.92而酚酞由于没有氧桥，分子不易 保持刚性平面，不易产生荧光刚性平面结构可以减少分子的 振动相碰撞去活的可能性一些有机配位剂与金属离子形成螯合物后荧光大大增强， 这也可用刚性结构的影响来解释例如，8一羟基喹琳本身荧光 较弱，与Mg2+形成螯合物后则是强荧光化合物再如，滂铭 BBR本身不发荧光，与A13+在pH=4.5时形成的螯合物发红色 荧光人13+-滂铭BBR螯合物.JPG取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响给电 子取代基如一OH、一NH2、一NR2和一OR等可使共轭体系增 大，导致荧光增强；吸电子取代基如一COOH、一NO和一NO, 等使荧光减弱，例如，苯胺和苯酚的荧光较苯强，而硝基苯为 非荧光物质。

随着卤素取代基中卤素原子序数的增加，物质的荧光减弱， 而磷光增强这种所谓的“重原子效应”是由于重原子中能级 交叉现象严重，容易发生自旋轨道偶合作用，使S1-T1的体系 间窜跃显著增加所致3 .环境因素对荧光的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中 可能表现出不同的荧光性质一般来说，电子激发态比基态具 有更大的极性溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定 作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大例如，奎 宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000温度对于溶液荧光强度的影响非常显著通常认为，辐射 跃迁的速率基本不随温度而变，而非辐射跃迁的速率随温度升 高而显著地增大因此，对于大多数荧光物质，升高温度会使 非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低由于三重态的寿命比单 重激发态寿命更长，温度对于磷光影响比荧光更大大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性 质受溶液pH的影响很大共轭酸碱两种型体具有不同的电子 氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种型体，各具有自己 特殊的荧光效率和荧光波长，例如：不同共轭体系的荧光.JPG不同共轭体系的荧光.doc溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的 胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用， 减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。

由于氧分子的顺磁性质，溶液中溶解氧的存在，使激发单 重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率 降低其它顺磁性物质也有这种作用三) 荧光强度与溶液浓度的关系根据荧光效率的定义，荧光强度If应为所吸收的辐射强度Ia与荧光效率件的乘积：E 5时由于 A = lg I0 I=IO-10"A可得 If=9/0(1-10-A)(5 —3)T "cc,(-2.3 A* (- 2.3 A*I 广气10 2.3 A - 2! 一 3!如果溶液很稀，吸光度A<0.05，方括号中其它各项与第一项相比均可忽略不计，则上式可简化为尸.3",=2.3"处 (5—4)可见，当A<0.05时，荧光强度与物质的荧光效率、激发光 强度、物质的摩尔吸收系数和溶液的浓度成正比对于一给定 物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与溶液浓度有 关：I=Kc (5 — 5)上式为荧光定量分析的基本依据以荧光强度对荧光物质 的浓度作图，在低浓度时，呈现良好的线性关系当荧光物质 的溶液浓度较高时，荧光强度同浓度之间的线性关系将发生偏 离，有时甚至随溶液浓度增大而降低（图5-02荧光强度与溶液浓度的关 系皿图5-2）导致标准曲线弯曲的原因，除了式（5-3）中的高次 项影响外，还存在猝灭效应。

荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所 发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程与荧光物质 分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质、称为荧光猝灭 剂前面提到的氧分子及产生重原子效应的漠化物、碘化物等 都是常见的荧光猝灭剂由荧光物质自身引起的荧光强度减弱 的现象称为荧光自猝灭效应经常遇到的自猝灭现象有两种 一种是当荧光物质发出的荧光通过溶液时被荧光物质的基态分 子所吸收，即自吸收现象另一种是由于激发态分子之间的碰 撞，导致非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低很显然，不论 哪种情况，增大荧光物质的浓度均会使荧光猝灭效应增强，从 而导致标准曲线向浓度轴弯曲，即使荧光强度降低四）荧光的激发光谱和发射光谱以不同波长的入射光激发荧光物质，并在荧光最强的波长 处测量荧光强度，以激发波长为横坐标荧光强度为纵坐标绘 制关系曲线，便得到荧光激发光谱激发光谱实质上就是荧光 物质的吸收光谱若固定激发光的波长和强度不变，测量不同 波长下的荧光强度，绘制荧光强度随波长变化的关系曲线，使 得到荧光发射光谱，简称荧光光谱激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和荧光测量波长的依据，也可用于鉴别 荧光物质。

三、荧光分析仪器常用的荧光分析仪器也是由光源、单色器、液槽、检测器 和信号显示记录器五部分组成它与分光光度计比较主要差别 有两点第一，荧光分析仪器采用垂直测量方式，即在与激发 光相垂直的方向测量荧光（图5-03荧光分析仪器示意图.doc图5-03荧光分析仪 器示意图.jpg如图5-3所示），以消除透射光的影响第二，荧光分 析仪器有两个单色器，一个是激发单色器，置于液槽前，用于 获得单色性较好的激发光；另一个是发射单色器，置于液槽和 检测器之间，用于分出某一波长的荧光，消除其它杂散光干扰 ㈠光源荧光测量中的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更 大的发射强度在荧光计中，常使用卤钨灯作光源；在荧光分 光光度计中，通常采用高压汞灯或氙弧灯作光源高压汞灯是 利用汞蒸气放电发光的光源，其光谱略呈带状，以365nm的谱 线为最强荧光分析中常使用365nm、405nm和436nm三条谱 线高压氙弧灯是荧光分光光度计中应用虽广泛的一种光源氙灯是一种短弧气体放电灯，工作时，在相距约8mm的钨电极 间形成一强电子流（电弧），氙原子与电子流相撞而解离为正离 子，氙正离子与电子复合而发光，其光谱在。