实验八 Rubisco活性的测定.docx

RuBP 羧化酶活性测定一、实验目的了解核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)在光合作用中的作用，掌 握比色法测定 Rubisco 的原理和方法二、实验原理RuBP 羧化酶是一种双功能酶，是光合作用中的关键酶，是一个双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故全名为RuBP羧化酶/加氧酶 (RuBP carboxylase/oxygenase，简称Rubisco)，普遍存在于自养生物中，在C3植 物中含量较为丰富在卡尔文循环中，Rubisco催化CO2的固定，生成2分子的 3-磷酸甘油酸；同时又能催化将氧气加在核酮糖-1,5-二磷酸的C2位置上生成1 分子的磷酸乙醇胺和1分子的3-磷酸甘油酸，这两个反应的速率由细胞内O2和 co2的相对浓度调节Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸 甘油酸激酶和 3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生 3-磷酸甘油醛，并使还原型 辅酶I (NADH)氧化反应如下：RuBP+CO2+H2O 2PGA3-PGA+ATP——1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+ 3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，1分子的CO2被固定，2分子NADH被氧化。

因此，从 340nm吸光度的变化可计算NADP的减少量来计算酶活力三、 实验材料与试剂1. 实验材料：小麦和玉米2. 试剂药品：Rubisco提取介质；反应体系；ATP溶液；磷酸肌酸溶液；磷酸肌酸激酶溶 液；3-磷酸甘油酸激酶溶液；3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液；RuBP溶液；ATP； NADH 溶液四、 实验仪器及用品紫外分光光度计，冷冻离心机，研钵，移液枪，剪刀，胶头滴管等五、实验方法与步骤1.酶粗提液的制备取新鲜的玉米与小麦叶片各 0.1g 于预冷的研钵中，加入 1ml 的酶提取液充 分研磨，转入2ml的离心管中，12000g 4°C离心lOmin,弃沉淀，上清液即为粗 酶提取液2. 活力测定按照下表加入 Rubisco 反应体系，将配好的反应体系摇匀，倒入比色杯中， 340nm调零调零后将50卩1 RuBP和20卩1粗酶液加入比色杯中，并立刻计时，每 隔 5s 测定 1 次吸光度，直至反应的吸光度不在变化，停止测定以单位时间内 吸光度下降的绝对值计算酶活性表 1 Rubisco 反应体系试剂加入量(ul)反应液630磷酸肌酸50磷酸肌酸激酶503-磷酸甘油酸激酶503-磷酸甘油醛脱氢酶50RUBP50ATP50340nm调零酶提取液20NADH503. 叶绿素的测定称取小麦和玉米的叶片各O.lg，置于研钵中，加入少量的80%的丙酮充分研 磨成匀浆。

取滤纸一张，放入漏斗中用80%的丙酮湿润，吧提取液倒入漏斗中， 滤入10ml的容量瓶中，用少量丙酮洗研钵数次，最后连残渣一起倒入容量瓶中, 用 80%的丙酮定容把色素提取液倒入 1cm 的比色杯中，用分光光度计分别在 645nm、663nm 下测定吸光度，以 80%丙酮做空白对照4. 结果计算(1) 叶绿素总量(mg/l)=叶绿素a含量+叶绿素b含量=20.29xA645+8.02xA663(2) 叶绿体色素含量(mg/g FW)=(C x Vt) x稀释倍数/FW式中：C—叶绿体色素的浓度(mg/1)； FW—鲜重(g)； Vt—提取液总体积(ml)；(3) Rubisco 的羧化活力(ymol/ml/min)=(AAxV 样)/(2xdxgxV 反xAtxch(a+b)xFw) 式中：AA—单位时间内340nm处吸光度变化值；At—测定时间V —提取液体积（ml） ; d一比色杯光程（cm）； Fw—样品鲜重 样g—每毫摩尔NADH在340nm的摩尔消光系数，为6.22V 一反应液体积（ml）； ch（a+b）—叶绿素含量（mg/g） 反六、实验结果1、不同种材料叶绿素含量玉米小麦A6450.2580.407A6630.5340.830叶绿素总量（mg/l）9.49214.874FW(g)0.10350.1Vt(ml)1010叶绿体色素含量（mg/g FW）0.9171.4872、不同种材料 Rubisco 羧化活力玉米小麦AA0.2170.945V 样(ml)样11d (cm)0.40.4g6.226.22V (ml) 反0.020.02At(min)1.55.5叶绿素含量（mg/g）0.91731.487Fw(g)0.10450.1Rubisco 的羧化活力(ymol/ml/min)15.1711.61七、讨论玉米和小麦分别是C3植物和C4植物的典型作物。

C4植物与C3植物相比, 它们具有在高光强、高温及低CO2浓度下保持高光效的能力由实验结果看出， 玉米和小麦叶片叶绿素含量分别为0.917 mg/g FW和1.487 mg/g FW，小麦叶片 的叶绿素含量明显高于玉米玉米和小麦叶片Rubisco活性也存在差异，玉米叶 片中 Rubisco 活性大于小麦叶片中 Rubisco 活性但仅从叶绿素含量和 Rubisco 活性就判断 C4 植物的高光和速率是不够的，需要进一步的对气孔导度，胞间 CO2 浓度等数据进行测量。