啤酒酵母蔗糖酶提取、 分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验.doc

3,5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作葡萄糖含 量（mg）0.00 0.4 0.8 1.2 2.0 2.8 3.6 4.0 A5400.000 0.058 0.162 0.261 0.437 0.603 0.737 0.868 Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作标准液蛋白质浓度（g/ml）0.00 4.17 8.33 16.67 25.00 33.33 41.67 A6500.000 0.098 0.169 0.339 0.451 0.592 0.704 米氏常数1/A4.8763.9853.3702.8312.4602.0321.8311/S100.080.066.750.040.026.720.0正交实验结果分析：啤酒酵母蔗糖酶提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验一、实验目的1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项；2、掌握 3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法；3、掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；4、掌握酶蛋白分离提纯的原理；5、掌握酶的比活力测定及其计算方法；6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法；7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。

二、实验原理1、蔗糖酶的提取细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液材料不同，破壁的方法也不同我们用的酵母菌细胞破壁方法有机械（匀浆）法、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法、溶胞作用 (酶溶解法)、自溶法，本实验采用自溶法自溶法即将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来2、蔗糖酶的纯化（1） 酶的蛋白属性① 两性电离： 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团② 等电点 (isoelectric point, pI) ：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点③ 大分子(胶体) : 分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达 1～100nm，为胶粒范围之内 ④ 稳定的因素: 颗粒表面电荷、水化膜（2）调节酶溶解度的方法；① 改变离子强度；盐析、硫酸铵分级沉淀 （反抽提法）反抽提法（Back Extraction）例：E.coli RNA聚合酶 42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀通常方法：先 33%-------再 50%反抽提法：再 42%将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。

蛋白从溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特异性② 改变pH或温度；酶在未纯化之前 pI也是未知的，pH不宜变化过大，以免失活Cu,Zn-SOD的纯化可在 70 oC，10 min③ 改变介电常数；有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法• 亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀• 亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集有机溶剂分级沉淀操作条件的控制：常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5-2% 为好3）根据酶分子大小、形状不同的分离方法离子交换层析：以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术离子交换分离的基本步骤---平衡-上样-吸附-洗脱-再生。

选择离子交换介质时应注意对pI=5的某酸性蛋白质，当蛋白质为阴离子时在 pH5.5-9.0 的范围内应选阴离子交换剂；当蛋白质为阳离子时，在 pH3.5-4.5 的范围内应首选阳离子交换剂本实验我们选用DEAE-52 离子交换层析3、各纯化级别蔗糖酶的活力测定酶活力 (enzyme activity)：酶催化某一反应的能力，位时间内单位体积中底物 (substrate) 的减少量或产物 (product) 的增加量，也称为比活性，一般用U/mg蛋白质来表示，有时也可用每g或每ml 酶含多少个活力单位来表示活力 (或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是酶纯度的量度，是每毫克酶的催化活力数 (U/mg蛋白)在酶的纯化过程中它的比活力逐渐升高，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定 本实验中采用DNS 法测定蔗糖酶活力① 3,5-二硝基水杨酸比色定糖的原理：② 蔗糖酶活力测定的原理：1）蔗糖酶催化的反应是： 2）蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克还原糖所需的酶量定义为一个活力单位3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少4、蔗糖酶的蛋白浓度测定 ①紫外吸收法：原理：大多数蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光 280nm 有收峰，可以进行蛋白质含量的测定优点：样品不需要经过预先处理，即可直接进行测定。

方法简单而快速，又不损害样品中的蛋白质，测定之后的样品仍可作他用样品中有硫酸或其他盐类存在也不影响测定在柱层析分离酶或蛋白质时，常为人们所采用缺点：核酸在 280nm 也有吸收，干扰测定，但核酸的最大吸收峰在 260nm不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来误差计算公式： 蛋白质含量(mg/ml)=1.55A280―0.76A260②Folin-酚法 (Lowry法) 这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一，由于方法简便，灵敏度高，常为实验室所采用，也是文献上用得最多的方法之一原理: (A) 凡含有两个及两个以上肽键 (-CO-NH-) 的化合物在碱性溶液中 (如Folin-甲试剂) 都能与 Cu2+ 作用，形成紫色的复合物； (B) 所有的蛋白质均可与 Folin-甲试剂反应形成紫色的铜-蛋白质复合物； (C) 铜-蛋白质复合物在 pH=10 的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸 (Folin-乙试剂) 还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅 (在一定范围内)与蛋白质的含量成正比5）、蔗糖酶酶促反应动力学研究① 酶促反应动力学(Kinetics of enzyme-catalyzed reaction )是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学，是酶工程研究中的一个重要内容。

其影响因素有：pH值、温度、酶浓度、底物浓度、激活剂、抑制剂等② 酶促反应动力学方程式——米氏学说 [S]： 底物浓度、Ｋm： 米氏常数、Vmax：最大反应速度、V： 不同[S]时的反应速度米氏常数（Km）的意义① Km值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶的 浓度无关② Km值作为常数只是对一定的底物、一定的pH、一定的温度 条件而言，测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段③ 1/ Km可以表示酶对底物亲和力的大小, 1/ Km越大, 表明亲和 力越大, 多底物酶有不同的 Km值, 最适底物的Km值最小实验中采用双倒数法计算米氏常数： 将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：以1/V对1/[S]作图得一直线，其斜率是Km/Vmax，在纵轴上的截距为1/Vmax, 横轴上的截距为-1/Km6）、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响正交试验设计 (Orthogonal experimental design)：是研究多因素多水平的一种设计方法，它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点。

是一种高效率、快速、经济的实验设计方法日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表正交试验设计中，因素可以定量的，也可以是定性的，定量因素各水平间的距离可以相等也可以不等正交试验法优点：（1）试验点代表性强，试验次数少 （2）不需做重复试验，就可以估计试验误差 （3）可以分清因素的主次 （4）可以使用数理统计的方法处理试验结果正交试验（表）法的特点：（1）均衡分散性─代表性 （2）整齐可比性─可以用数理统计方法对试验 结果进行处理A1 A2 A3B3B2B1C1C2C3123654789 因素水平A温度（℃）BpH值C离子浓度（mol/L）1402.60.052504.60.103606.60.15本实验因素水平表用 正交实验法只需要9次实验三、本实验的注意事项1、这个实验较大，涉及到的理论知识和实验技术都比较多用的时间也很长，要求同学们一定做好预习，把预习过程中有问题的部分记下，实验之前和老师或同学讨论。

2、写好预习报告，要求简洁明了(并留出记录实验数据和实验现象的位置)，否则将严重影响实验进度！3、本实验从一开始，就要纵观全局，在各个环节都要注意防止酶失活，只要时间允许，一定要用测定酶活力的方法去跟踪4、重复实验时，注意条件的严格一致性5、在实验过程中，必须认真对待每一个测定的点，任何一个数据的丢失，都将直接导致整个实验数据分析的失败6、本实验中未考察到的其它因素(如：移液管、操作人员、反应时间、测试仪器等)一定要严格控制，保持固定不变7、实验时一定要按照预习步骤和仪器使用操作规程操作。