酶的组织化学培训教材.ppt

酶的组织化学 酶组织化学反应主要经过两步：1.酶促反应，即酶催化细胞内相应底物，生成无色的初级反应底物2.显色反应，捕获和偶联将初级反应产物与捕获剂反应，经过一步或两步反应生成有色的最终反应产物，或将初级反应产物与一些偶联剂发生偶联反应生成有色沉淀，显示酶活性部位遵循原则：1.尽量保持组织细胞生活时的形态和结构2.尽量保持组织细胞生活时酶及其他成分的活性，不影响酶的活性和分布3. 底物和辅助剂必须迅速而同步地渗透到组织和细胞中去4. 底物最好只能被一种酶催化分解 7. 由于酶的活性可受到很多因素影响，因而在酶生化方面有许多要求，以保证充分显示酶的活性： 最适孵育温度（25-37C） 最适pH值 最适底物及辅助物浓度 激活剂与抑制剂 酶的组织化学方法基本原理沉淀反应法 1. 金属盐法（金属阳离子沉淀反应）由于酶的活性可使孵育底物分解，其生成的基团可与金属离子结合而产生沉淀，最后在酶的活性部位生成不溶性的有色金属盐沉淀如钙-钴法显示碱性磷酸酶 2. 偶联偶氮色素法 由于酶活性可使含萘酚的底物化合物分解，其分解产物可与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性的偶氮色素，以证明酶的活性部位 电子传递法 根据氧化还原的原理显示氧化酶和脱氢酶。

脱氢酶的作用使底物脱氢氧化，脱下的氢可与作为受氢体的无色四唑盐或双四唑盐结合，后者被还原成甲或双甲潜紫蓝色沉淀如琥珀酸脱氢酶显示方法属于此法 水解酶类 水解酶催化下列反应 ： AB+H2O AH+BOH 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等 碱性磷酸酶钙-钴显示法 原理：AKP在有激活剂（Mg+）存在和pH9.4时，将磷酸盐底物分解产生磷酸根离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的钙盐所捕获，在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀，再加入硝酸钴，用Co2+置换 Ca2+ ，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色需通过硫化铵处理形成黑色硫化钴颗粒沉淀，显示酶活性所在部位，此沉淀与AKP含量成正比 试剂配制： 1. 作用液 2%巴比妥钠 5ml；3%-甘油磷酸钠 5 ml；2%无水氯化钙 10ml；0.1%硫酸镁 0.5 ml；蒸馏水 2.5 ml 此液pH为9.4，如不到9.4，可用0.1N NaOH调节2. 2% 硝酸钴 3. 1-2% 硫化铵 （现配） 操作步骤 1. 新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育液37C 10-40 分钟 2. 流水洗2分钟 3. 2%硝酸钴5分钟 4. 蒸馏水洗 5. 硫化铵30秒-1分钟。

6. 蒸馏水洗 7. 甘油明胶封固 碱性磷酸酶结果： AKP所在部位呈黑色硫化钴沉淀 6-磷酸葡萄糖酶结果：酶活性处为棕黄色硫化铅沉淀，细胞核为阴性反应 对照 去底物对照，作用液中以蒸馏水代替-甘油磷酸钠，其他步骤同上，酶反应阴性 氧化还原酶催化氧化还原反应的酶 琥珀酸脱氢酶（SDH）硝基四唑盐法 原理：琥珀酸脱氢酶（SDH）作用于底物琥珀酸钠，脱下氢，以无色的硝基四唑盐为受氢体，后者获氢后被还原为不溶于水的有色甲潜，原位沉积于酶活性部位 试剂配制 0.2M磷酸缓冲液pH7.6 5ml1A液 0.2M琥珀酸钠 5ml B液 0.1%（1mg/ml）硝基四唑盐（Nitro-BT） 10ml 临用前将两液等量混合，调整pH至7.6 操作步骤： 1. 新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育液37C 5-40分钟 2. 蒸馏水洗 3. 甘油明胶封固 琥珀酸脱氢酶 结果： 酶活性部位为紫蓝色颗粒沉淀 对照 另配一孵育液，以等量的蒸馏水代替0.2M琥珀酸钠液，酶活性部位呈阴性 注意事项： 1. 取材要迅速，立即低温冷冻，否则容易引起酶的扩散 2. 为节省染液，可采用滴染，使孵育液盖过切片，置于湿盒内孵育。

3.若孵育液中加二甲亚砜1ml，可使线粒体的膜通透性增加，作用快，酶定位清晰。