哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南.pdf

ICS 070 08 A40 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB T XXXXX XXXX 哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南 General guidance on detection methods of mammalian cell cross contamination 征求意见稿 XXXX XX XX 发布 XXXX XX XX 实施 GB T XXXXX XXXX 1 目 次 前言 2 1 范围 3 2 规范性引用文件 3 3 术语和定义 3 4 缩略语 4 5 细胞交叉污染检测原则 5 6 细胞交叉污染检测方法 5 7 检测方法选择原则 7 8 检测要求及结果判定 9 9 质量控制 10 10 其他 11 11 报告 11 附录 A 规范性附录 细胞交叉污染检测方法 12 附录 B 规范性附录 细胞交叉污染检测报告模板 13 参考文献 14 GB T XXXXX XXXX 2 前 言 本标准按照 GB T 1 1 2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化委员会 SAC TC 387 提出并归口 本标准起草单位 深圳华大生命科学研究院 本标准主要起草人 张曦 岳建辉 侯勇 李波 马启旺 孙长斌 GB T XXXXX XXXX 3 哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南 1 范围 本标准提出了细胞交叉污染的检测原则 检测技术 技术选择原则 检测要求及判定标准等通用要 求 本标准适用于哺乳动物细胞特别是人源细胞 不适用于非哺乳动物细胞 如细菌 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件 仅所注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于本文件 ASN 0003 2015 基于线粒体细胞色素氧化酶亚基1 CO1 DNA条形码鉴定动物细胞种属 Species Level Identification of Animal Cells through Mitochondrial Cytochrome Oxidase Subunit 1 CO1 DNA Barcodes ASN 0002 2011 人类细胞系的身份鉴别 标准化的STR分析 Authentication of Human Cell Lines Standardization of STR Profiling ISCN 2013 人类细胞遗传学国际命名体制 2013版 An International System for Human Cytogenetic Nomenclature 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3 1 细胞系 cell line 指由原代细胞或细胞群经传代培养而获得的具有非均质性特征的细胞群 ISO 21427 2 2006 定义3 1 3 2 细胞交叉污染 cell cross contamination 指细胞在分离 培养等过程中 与来源于种属内或种属外的非目标细胞之间发生的相互污染 3 3 种属间细胞交叉污染 inter species contamination of cells 指来源于两种或者两种以上不同种属的细胞发生混合 3 4 种属内细胞交叉污染 intra species contamination of cells GB T XXXXX XXXX 4 指来源于同一种属内的同类型细胞 不同个体 或不同类型的细胞 相同或不同个体 发生混合 3 5 短串联重复序列 short tandem repeat 指重复序列为2到13个碱基对 重复次数可以为5次到上百次 且不同的重复序列以相邻形式排列的 基因片段 ISO 25720 2009 定义4 26 3 6 核型分析 karyotype analysis 将待测细胞的染色体按照固有的染色体形态特征和规定 进行配对 编号和分组 并进行形态分析 的过程 3 7 同工酶分析 isoenzyme analysis 指具有相似或相同特异性的酶 利用琼脂糖凝胶电泳技术 研究细胞裂解过程中同工酶的迁移规律 以获得具有物种特异性的同功酶谱的过程 3 8 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 指通过DNA互补双链解链 退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法 SN T 1195 2003 定义 3 2 3 9 流式细胞术 flow cytometry 指对悬液中的单细胞或其他生物粒子 通过检测标记的荧光信号 实现高速 逐一的细胞定量分析 和分选的技术 3 10 单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism 是一种发生在基因组特定位置的单个核苷酸A T C或G的变异而引起的DNA序列的改变 且每个变 异在人群中都以相对可观的比例存在 比如 1 造成的包括人类在内的物种之间染色体基因组的多 样性 ISO 25720 2009 en 定义4 23 4 缩略语 下列缩用语适用本文件 DNA 脱氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid RNA 核糖核酸 ribonucleic acid GB T XXXXX XXXX 5 STR 短串联重复序列 short tandem repeats SNP 单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism HLA 人类白细胞抗原 human leukocyte antigen PCR 聚合酶链反应 polymerase chain reaction FACS 荧光激活细胞分选仪 fluorescence activated cell sorting MEF 小鼠胚胎成纤维细胞 mouse embryonic fibroblasts 5 细胞交叉污染检测原则 5 1 细胞交叉污染检测总则 细胞交叉污染可分为种属间 种属内细胞交叉污染两类 细胞交叉污染的检测原则包括 检测种属 间细胞交叉污染 检测种属内不同个体间细胞交叉污染 细胞专属特性检测 在进行细胞交叉污染检测 时 应依次进行种属间细胞交叉污染 种属内细胞交叉污染 细胞专属特性检测 5 2 种属间细胞交叉污染检测原则 种属间细胞交叉污染是由于来源不同种属 两种或以上 的细胞之间发生混合导致 不同种属来源 的细胞生物学特征差异可包括 生物化学特征 如同工酶 表面抗原 细胞遗传学特征 如染色体核型 标记染色体 免疫学特征 如组织相容性抗原 特异性免疫血清 种属间细胞交叉污染的检测方法应以能区分不同种属的差异性特征进行选择 种属间细胞交叉污染检测方法可包括染色体核型分析 同工酶谱分析 聚合酶链式反应 PCR法 及CO1 DNA条形码分析等方法 根据检测目的 应至少选择上述一种或几种方法对细胞的种属来源进行 鉴别 5 3 种属内细胞交叉污染检测原则 种属内细胞交叉污染应检测相同种属内不同个体来源的细胞之间发生的相互污染 种属内细胞交 叉污染检测应基于不同个体间的差异特征进行检测 相同种属内不同个体间的差异特征可包括 形态学特征 如圆形 长梭形 聚团生长等 遗传标记 STR SNP 等 种属内细胞交叉污染检测方法包括短串联重复序列 STR 基因分型 单核苷酸多态性 SNP 分析 人类白细胞抗原分型等方法 根据检测目的 应至少选择上述一种或几种方法对种属内细胞交叉污染进 行鉴别 5 4 细胞专属特性检测原则 细胞专属特性可包括细胞表面标记物 报告基因 典型的细胞形态特征及特异性表达产物等 细胞专属特性检测方法可包括流式细胞术 免疫荧光染色 酶联免疫吸附试验等方法 根据细胞专 属特性 应至少选择上述一种或几种或其他等效方法对细胞的专属特性进行检测 6 细胞交叉污染检测方法 6 1 细胞交叉污染检测方法通则 GB T XXXXX XXXX 6 细胞交叉污染检测的方法包括细胞形态学分析 同功酶谱分析 染色体核型分析 人类白细胞抗原 HLA 基因型检测 PCR法 流式细胞分析 免疫荧光染色 短串联重复序列基因分型法 单核苷酸多 态性分析 报告基因检测等 检测人员应根据细胞类型 应用范围和待检样本类型选择一种或者多种方 法进行检测 6 2 细胞形态学分析 对于贴壁细胞 可通过细胞形态 生长特性等形态学特征初步判断细胞之间是否发生交叉污染 对 于悬浮细胞 可通过分析细胞尺寸 体积等形态学特征初步判断细胞之间是否发生交叉污染 若观察到细胞培养物形态学特征差异明显或疑似出现细胞交叉污染 建议选择其他检测方法进一 步鉴定 6 3 同工酶谱分析 不同种属来源的细胞在同工酶谱分布上具有差异 通过凝胶电泳分离后 对电泳带型和相对迁移 距离进行分析 可用于种属间细胞交叉污染检测 种属间细胞交叉污染可采用商业化的同工酶谱分析试剂盒进行检测和分析 注 同工酶谱分析可能具有较低的灵敏度 在细胞污染量较小 10 情况下 该法可能无法准确检测种属间细胞交 叉污染 6 4 染色体核型分析 不同种属来源的细胞在染色体形态 结构 数目 长度 着丝点位置 臂比 随体大小等特征存在 差异且相对稳定 可以用于对种属间的细胞交叉污染进行检测 染色体核型分析可包括 形态分析 带型分析 着色区段分析 染色体核型分析可根据ISCN 2013 建立的G显带法进行核型分析和描述 注1 亲缘关系接近的灵长类动物细胞的染色特征比较接近 采用该法进行鉴定应仔细辨别每一谱带的特点 注2 转化细胞可能出现非整倍体和异倍体 染色体核型分析不适用此类型细胞的种属鉴定 6 5 人类白细胞抗原 HLA 基因型检测 人类白细胞抗原基因分型技术仅适用于不同个体来源的人源细胞系之间的交叉污染 HLA因其高度多态性而成为最能代表个体特异性并伴随个体终身的稳定的遗传标志 在无关个体之 间HLA型别完全相同的几率极低 通过检测细胞HLA基因型可以检测细胞是否存在交叉污染 基于PCR SSP的HLA基因分型技术具有较高的准确性和灵敏度 采用该法进行人类白细胞抗原基因分 型的鉴定可采用基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测技术进行 6 6 PCR 法 PCR法检测细胞交叉污染是基于种属间进化保守性差异建立的检测方法 具有较高的灵敏度和特异 性 细胞色素b和细胞色素C氧化酶1 Cytochrome c oxidase subunit 1 CO1 等保守基因在不同种属 间具有较大差异 可被用于进行细胞交叉污染的检测 CO1 DNA条形码技术鉴定细胞种属具有较高的特异性和灵敏度 可快速 准确鉴定细胞系种属 采用CO1 DNA条形码分析进行种属间细胞交叉污染检测可依据ANSI ATCC 0003实施 6 7 短串联重复序列基因分型法 短串联重复序列 Short Tandem Repeats STR 基因分型法检测细胞交叉污染的原理是在单管中 同时扩增多个多态性DNA片段 因为不同个体来源的细胞在不同STR位点具有特异性的重复次数 因而使 GB T XXXXX XXXX 7 得不同细胞具有其特征性的图谱 根据STR图谱的分析即可检测种属内细胞是否存在不同个体来源的细 胞交叉污染 短串联重复序列 Short Tandem Repeats STR 基因分型法具有高灵敏度 高鉴别能力和标准化 自动分型等特征 采用短串联重复序列基因分型法进行人源细胞系交叉污染 不同个体 检测可依据ASN 0002 2011 实施 注 STR基因分型技术目前仅适用于不同人源个体之间的细胞交叉污染检测 暂不适用于其他种属细胞交叉污染的 检测 6 8 单核苷酸多态性 SNP 分析 单核苷酸多态性是指多个位点的单个核苷酸变异形成的遗传标记 从而引起遗传物质的高度多态 性 因此可利用其多个位点的联合分析以获得不同细胞各自的SNP特异性图谱 从而进行不同来源细胞 交叉污染的鉴定检测 与STR检测技术类似 其全自动的检测操作以及大量的数据库参考基础使得SNP基 因分型法可较好的替换或者补充传统细胞系鉴定技术体系 并可以较好的弥补STR等位漂移等不稳定情 况而造成的STR检测结果的误判 形成。