胡椒醇提液外用对兔耳冻伤的治疗研究.doc

胡椒醇提液外用对兔耳冻伤的治疗研究　　 邓永坤，赖泳，董寿堂，王银辉，李凤贤　　【摘要】目的讨论胡椒醇提液外用对兔耳轻度冻伤的治疗效果方法用－15℃左右低温液复制兔耳轻度冻伤模型，冻伤后48h开始在兔冻耳涂抹胡椒70%乙醇提取液治疗，2d后测定血清中SD活性、DA和TNF-α含量，4d后评价冻耳外观正常与否及变形程度，制作冻耳组织病理切片，显微镜下观察冻耳组织病理变化，同时测定血清与冻耳组织中SD活性、DA和TNF-α含量结果用胡椒70%乙醇提取液治疗2d后血清中SD活性显著增加，DA量显著降低，TNF-α量无明显变化治疗4d后血清中SD活性、DA和TNF-α含量均无明显差异，但冻耳组织中SD活性与TNF-α程度显著进步，DA量显著降低另外冻耳外观评价与组织病理检查显示冻耳组织坏死范围减少，修复速度明显进步结论胡椒70%乙醇提取液局部外用对轻度冻伤有治疗作用　　【关键词】胡椒；冻伤；治疗作用　　Abstrat：bjetiveTinvestigatethetherapeutieffetfalhlextratfrpeppernildandderatefrstbitefrabbitear.ethdsTherightrabbitear,ithin7spefrapexnhaeauristardsulusauriulaepsterir,asiersedintldliquidat-15℃testablishanexperientaldelfildandderatefrstbite.2dafterfrstbite,70%alhlextratfrpepperasappliedntsurfaefearsfrzen.SDativity,DAandTNF-αlevelsinserueredeterined2and4daftertreatent.Thenafterappliatinfr4d,SDativity,ntentsfDAandTNF-αintissuefearfrzeneredeteted.Inadditin,thereveryprfilesfearfrzenlikeappearanevariablesandhistpathlgifeatureseresurveyed.ResultsSDativityinserusignifiantlyinreased2daftertreatentith70%alhlextratfrpepper,DAlevelsignifiantlydereasedandTNF-αlevelhadndifferene.SDativity,DAandTNF-αnentratinsinserushedndifferenesafteradinistratinfr4d.Intissueftheaffetedear,SDativityandTNF-αntentserebviuslyathighlevelsatthistie,DAntentastheppsite.nthetherhand,theappearanerevieandhistpathlgiexainatinbthanifestedthattpialappliatinf70%alhlextratfrpepperdiinishednertireginsfearfrzen,aeleratedtissuerepairafterfrstbite.nlusin70%alhlextratfpepperhaspharalgialativitynildandderatefrstbitehealing.　　Keyrds：Pepper;Frstbite;Therapeutieffet胡椒是传统中药，为胡椒科植物胡椒PipernigruL.的枯燥近成熟或成熟果实。

民间有用胡椒粉煮水或泡酒擦洗患处治疗冻疮的用法，并且疗效确切笔者所在研究组欲对胡椒抗冻疮作用进展动物实验验证，通过查阅中外文献数据库〔包括中国NKI和VIP科技论文全文数据库，美国Gale、Pubed和HighirePress数据库〕，未能检索到动物冻疮实验模型的报道研究组曾根据冻疮病因病机试制动物冻疮模型，但均未成功临床上认为Ⅰ，Ⅱ度〔轻度〕冻伤和冻疮的临床表现及治疗根本一致，因此在没有冻疮动物模型可用的情况下，药物对轻度冻伤的疗效仍可作为对冻疮治疗作用的参考，有积极意义兔耳冻伤后由于局部细胞发生变性或坏死，兔耳形态和组织构造会有所改变，变性的细胞如及时恢复供血供氧，去除损伤因子，能转为正常，反之，如持续缺血缺氧，那么损伤可进一步加重，直至坏死坏死表皮可由周围正常表皮再生修复，真皮坏死那么只能通过肉芽组织填补修复，修复后兔耳形态和组织构造不能恢复正常；另外，因冻伤后机体氧化抗氧化系统平衡被打破，丙二醛〔DA〕和超氧化物歧化酶〔SD〕这对反映组织氧化损伤程度与抗氧化才能的生化指标会发生相应变化；近年来肿瘤坏死因子α〔TNF-α〕在创伤和创伤修复中的作用越来越受人们关注现已证实，在创伤修复早期TNF-α能诱导白细胞脱颗粒，增强其吞噬才能，加速肉芽组织及肉芽组织内新生血管形成［1～3］。

在修复中、后期高浓度TNFα能抑制成纤维细胞胶原蛋白基因的转录,同时可以引起胶原酶基因转录的显著增加,因此TNFα在组织的重塑中具有重要意义，可减少瘢痕组织形成，进步修复质量［4，5］也就是说，在创伤修复早期适当浓度的TNFα能加速创面修复，中、后期高浓度TNFα能进步修复质量［6］该文通过观察冻伤兔耳治疗后外观形态与组织病理改变情况，测定血清和冻耳组织中DA、SD、TNF-α含量综合评价胡椒局部外用对兔耳轻度冻伤的治疗作用，进而研究胡椒抗冻疮的效果　　1仪器与材料　　1.1仪器　　2022型酶标仪〔奥地利AnthsLabteInstruents公司〕；756紫外可见分光光度计〔上海精细科学仪器〕　　1.2试药　　取白胡椒〔购自东骏大药房〕，用70%乙醇冷浸3次〔48，24，24h〕，合并浸提液，静置分层，过滤，滤液用70%乙醇配制为高、中两种浓度供试液，每毫升分别相当于生药3.30，1.65g；DA和SD试剂盒〔南京建成生物工程研究所，批号分别为：20221228，20221227〕；TNFα试剂盒〔美国AdlitteraDiagnstiLabratries公司，批号：RT110371〕。

　　1.3动物　　日本大耳白兔40只，体质量2.0～3.0kg，雌雄兼用，由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：SXK〔滇〕2022-0008　　2方法　　2.1冻伤模型复制与给药　　［7］取家兔分为4组，即正常、溶剂和高、中浓度胡椒供试液组，每组10只，于实验室正常单笼饲养6d后将右耳耳尖至耳根7范围剪毛，隔日将右耳剪毛区域浸入〔-15±1〕℃冷冻液〔6份碎冰+1份氯化钠〕中，正常组除外待兔耳变白变硬后再冻30s，取出，空气中停留20s后以35℃温水复温20s，取出兔耳，擦干水分，冻伤模型复制完毕冻伤后48h开始在冻伤兔耳剪毛区域分别涂药，1l/次，3次/d，涂药4d后，治疗完毕　　2.2冻耳治疗后外观评价　　冻耳皱缩变形的范围大小反映了组织细胞坏死和瘢痕修复的范围大小，是药物对冻伤所致组织细胞变性的保护和促恢复作用的直接表达此处将冻耳治疗后外观评价由好到差分为4级：正常〔冻耳治疗后颜色、外观、触感和厚度与正常兔耳完全一样〕、轻度变形(冻耳耳尖至耳根方向2区域内皱缩变形)、中度变形(耳尖至耳根方向4区域内皱缩变形)、重度变形(耳尖至耳根方向皱缩变形范围超过4)　　2.3冻耳病理检查　　治疗4d后，家兔左耳耳缘静脉空气栓塞致死，立即沿浸冻线剪下冻耳浸冻局部，由耳尖垂直于浸冻线方向将冻耳浸冻局部剪成对称的两半，一半以4%甲醛溶液固定〔另一半留做SD、DA和TNF-α测定〕，分别在耳尖向耳根方向1，2，3处取材，常规石蜡包埋，HE染色，以正常兔耳为对照，显微镜下观察冻耳组织病理变化。

　　2.4SD、DA和TNFα测定　　2.5统计　　所有数据均用SPSS13.0统计，其中冻耳治疗后外观评价用秩和检验ann-hitneyU法，SD、DA和TNFα测定结果用方差分析LSD法　　3结果　　3.1冻耳外观变化　　复温后兔耳开始发红发热，随后变紫、肿胀、下垂肿胀逐渐加剧，12h后局部兔耳出现浆液性水泡，泡液无色或淡黄色，随后水泡增大或新水泡形成24h后肿胀程度不再增加，水泡不再增大或无新水泡形成48h后局部兔耳冻区有黄色液体渗出治疗后冻耳肿胀逐渐消退，治疗完毕〔治疗4d〕后各组冻耳均已不见明显肿胀高、中浓度胡椒供试液组治疗完毕后分别有4只和2只家兔冻耳外观同正常兔耳〔冻耳表皮光滑平整，未见坏死，冻耳颜色、触感、弹性和厚度均与未冻伤的左耳完全一样〕，其它家兔冻耳均有不同程度的皱缩变形和硬化、外表凹凸不平、表皮坏死，个别家兔冻耳外表有硬痂产生高浓度胡椒供试液组治疗完毕后冻耳外观评价明显好于溶剂组〔P0.01〕结果见表1表1胡椒对轻度冻伤兔耳形态改变的影响〔略〕　　3.2冻耳治疗后病理变化　　治疗后高、中浓度胡椒供试液组兔冻耳表皮均修复完好，真皮水肿及炎症均明显消退，局部兔冻耳真皮已无水肿和炎症表现〔高浓度5只，低浓度3只〕，近半数兔冻耳毛囊和皮脂腺数量正常〔高浓度6只，中浓度4只〕，未见毛囊和皮脂腺坏死，冻耳总体恢复程度和速度明显好于溶剂组，见图1。

转贴于论文联盟.ll.　　3.3SD测定结果　　治疗2d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中SD活力均显著高于溶剂组〔P0.01〕治疗4d后各组血清中SD活力已无明显差异，但冻耳组织中SD活力有明显不同，高、中浓度胡椒供试液组显著高于溶剂组〔高浓度P0.01，中浓度P0.05〕结果见表2表2胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中SD活力的影响〔略〕　　3.4DA测定结果　　治疗2d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中DA量显著低于溶剂组〔P0.01〕治疗4d后各组血清中DA量均一定程度下降，与正常组相比已无明显差异，但此时冻耳组织中DA量有差异，高、中浓度胡椒供试液组显著低于溶剂组〔高浓度P0.01，中浓度P0.05〕结果见表3表3胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中DA含量的影响〔略〕　　3.5TNF-α测定结果　　治疗2d和4d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中TNF-α量与溶剂组相比均无明显差异，但治疗4d后冻耳组织中TNF-α量显著高于溶剂组〔P0.01〕结果见表4表4胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中TNF-α含量的影响〔略〕　　4讨论　　兔耳冻伤后形态改变的范围实际上反映了冻耳存活的组织细胞面积和存活量。

所以，治疗完毕后，通过兔冻耳外观正常与否及形态异常范围可评价药物抗冻伤的疗效，药物如能减少耳冻伤后细胞坏死的数量和范围，那么冻耳形态改变区域就校此次研究结果显示，高浓度胡椒供试液能显著降低兔耳轻度冻伤后形态改变程度〔P0.01〕,并且治疗完毕后4/10冻耳形态与正常兔耳完全一致　　冻伤4d〔治疗2d〕后兔血循环中SD活力还明显低于正常，相应的脂质过氧化物DA含量明显高于正常，但胡椒供试液能显著增强血液中SD活力，减少DA的产生冻伤6d〔治疗4d〕后血循环中SD活力和DA程度根本恢复正常，但冻耳组织中SD活力明显低于正常，另外DA量也明显高于正常，更有意义的是胡椒供试液能显著增加冻耳组织中SD活力并降低DA程度由此说明，兔耳局部轻度〔主要是Ⅱ度〕冻伤后不仅能打破受冻局部组织氧化抗氧化系统的平衡，并且因此可使全身血循环中氧化抗氧化系统受累，最终导致失衡氧化抗氧化系统失衡的顺序为局部冻伤组织到全身血循环，而恢复的顺序那么正好相反另外实验结果也说明，冻伤局部应用胡椒70%乙醇提取液能有效增加机体抗氧化才能，抑制受冻组织氧化损伤　　兔冻耳局部胡椒供试液治疗2d和4d后血液中TNF-α程度与溶剂组相。