利用GUS基因表达观察启动子功能.ppt

实验七实验七 利用利用GUS基因表达观察启动子功基因表达观察启动子功能能一、实验目的一、实验目的1.1.了解报告基因及其应用；了解报告基因及其应用；2.2.学习启动子功能研究的方法学习启动子功能研究的方法1.真核基因转录调控的基本原理 在真核生物中，通过顺式调控元件和反式作用因子的相互作用，对基因表达进行调控二、实验原理顺式调控元件顺式调控元件 启动子启动子 Promoter 增强子增强子 Enhancer / 沉默子沉默子Silencerp 能被序列特异性DNA结合蛋白识别的DNA 位点p 为RNA聚合酶II启动转录及实现最大转录效率所需反式作用因子反式作用因子是一些能结合核心启动子和启动子近端元件的调控蛋白，能协助RNA聚合酶II启动转录，并与聚合酶形成启动复合物p基本转录因子Basal transcription factors p活化子Activators /抑制子repressorsThe molecular apparatus controlling transcription in human cells2.启动子（Promoter）z启动子是位于基因5‘端近旁的一段调控序列，能作为RNA聚合酶的结合位点，同时也是转录因子结合的位点。

z启动子的功能可以通过报告基因进行方便的检测 p是一种编码容易被检测的蛋白质或酶的基因p将某个基因表达调控序列与报告基因编码序列相融合，利用报告基因表达研究该基因表达调控p利用报告基因与其它目的基因融合蛋白的表达，进行蛋白定位3.报告基因(reporter gene) 报告基因的特点：报告基因的特点：1.报告基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物；2.受体细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测；3.报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好常用的报告基因常用的报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素转乙酰酶基因（cat）新霉素磷酸转移酶基因（npt-II)绿色荧光蛋白基因（gfp）冠瘿碱合成酶基因β-半乳糖苷酶基因 绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因green-fluorescent protein, gfp 一种腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，能在一定波长的紫外线激发下发出绿色荧光优点： 1.适用于各种生物的基因转化；2.检测方法简便，无需底物、酶、辅因子等物质；3.便于活体检测，十分利于活体内基因表达调控的研究Laser ablation of the quiescent center （静止中心）in the post-embryonic root(后胚根). Confocal scanning images (共聚焦扫描成像)from the same root. 拟南芥根部GFP的表达β-β-葡萄糖苷酸酶（葡萄糖苷酸酶（GUS））基因基因 由uidA编码，其产物是葡萄糖苷酶（β-glucuronidase)，该酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。

广泛用于转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在研究外源基因瞬时表达的转化实验中GUS检测方法检测方法组织化学染色定位法 (定性) 能够将无色的底物x-gluc催化生成蓝色的产物荧光法 （定量） 以4-甲基伞形酮酰-β-D葡萄糖醛酸苷为底物，GUS催化其水解为4-甲基伞形酮及β-D葡萄糖醛酸 4-甲基伞形酮分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量GUS activity in the shoot of Arabidopsis中柱内皮皮层表皮GUS activity in the shoot of Arabidopsis A: mature trichomes (表皮毛）; C, cotyledon guard cells (子叶和保卫细胞); D, stipules （托叶）; H, veins of cotyledon and hypocotyl (胚轴); N, veins of hypocotyl and cotyledon petiole（叶柄）; P, cotyledon and leaf blade (子叶和叶片) Scale bars 100 m.本实验原理简介 植物激素(Auxin)能调控植物生长和发育的各个方面，包括细胞分裂(cell division) 、细胞伸长(cell elongation) 、细胞分化(cell differentiation)和器官形成(the initiation of organ formation)等。

吲哚乙酸(IAA) 在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素Aux/IAA genes Aux/IAA基因家族编码18- to 35-kD的短命转录因子，加入生长素5~60分钟后，大部分AUX/IAA家族就表达 这类基因的启动子区含有TGTCTC生长素反应元 件 ( auxin-responsive promoter elements， AuxREs)1. 构建ProIAA2::GUS转基因拟南芥，利用GUS染色反应，观察IAA2基因表达的组织特异性及外源生长素对IAA2基因表达的影响GUSIAA2 promoterNos-terIAAmRNA本实验内容本实验内容观察观察GUS表达的组织特异性表达的组织特异性： 观察不同组织（根，叶等）GUS活性的强弱出现蓝色的地方即就是启动子工作的地方，即IAA2基因表达的地方观察影响基因表达的因素观察影响基因表达的因素： 影响GUS表达的因素就是影响启动子功能的因素如：外源生长素处理实验中, 我们将在根冠和原韧皮部看到蓝色，因此生长素是影响IAA2启动子工作的因子之一。

2.利用DR5::GUS转基因拟南芥，观察GUS阳性的位点，即体内auxin分布的特点pDR5是含有7个串联重复的生长素反应元件（TGTCTC）的人工构建的启动子pDR5 启动子活性的高低依赖于生长素的浓度，更快速、灵敏地反映了细胞内生长素的水平The DR5 reporter construct is widely used to monitor auxin response-level. DR5 consists of seven repeats of an auxin-response element (AuxRE) which is a binding site for auxin-responsive transcription factors (ARFs).实验材料实验材料|ProIAA2::GUS转基因无菌苗；|0.1M IAA处理1天的ProIAA2::GUS转基因无菌苗；|DR5(含有7个生长素反应元件)::GUS转基因无菌苗三、实验步骤三、实验步骤1.育苗： 将ProIAA2::GUS、ProDR5::GUS转基因拟南芥种子经表面消毒后接种于无菌的琼脂培养基。

2.生长素处理：将ProIAA2::GUS小苗转接至含有生长素(0.1M IAA)的新鲜培养基中处理1天3.取不同处理的材料（如整株小苗、叶片或根）放入微量离心管进行GUS染色，37ºC染色0.5-1.5h；如观察叶片，需要将染色后的叶片在95%乙醇浸泡5-60min，以除去叶绿素4.镜检: 在低倍镜或解剖镜下观察不同材料、不同组织、不同处理条件下GUS表达的部位及强弱差异pIAA2S::GUS, pIAA2L::GUS和DR5::GUS拟南芥幼苗GUS表达部位及响应生长素的差异;拟南芥根结构的模式图The DR5 Auxin Reporter Maximum in the Arabidopsis Root Is Modulated by Auxin Response2,4-D--+ReferenceAn Auxin-Dependent Distal Organizer of Pattern and Polarity in the Arabidopsis Root Cell, 1999(99): 463–472AUX1 Promotes Lateral Root Formation by Facilitating Indole-3-Acetic Acid Distribution between Sink and Source Tissues in the Arabidopsis SeedlingThe Plant Cell, 2002 (14): 589–597。